Toll样受体4信号通路分子与慢性心力衰竭严重程度和预后的关系分析

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(南华大学附属第二医院心血管内科,湖南 衡阳 421001)

·临床医学·

Toll样受体4信号通路分子与慢性心力衰竭严重程度和预后的关系分析

陈劲松，刘运阳，曾高峰，刘访遥，黄冰，袁慧英

(南华大学附属第二医院心血管内科,湖南 衡阳 421001)

目的探讨Toll样受体4(TLR-4)信号通路分子变化与慢性心力衰竭(CHF)严重程度和预后的关系。方法选择本院收治的117例CHF患者(病例组)和同期109例健康对照者(对照组)，采用流式细胞仪检测其外周血单核细胞中TLR-4、核转录因子kappa B(NF-κB)和髓样分化因子(MyD88)的表达情况，分析它们与CHF的心功能分级、浆膜腔积液、再次入院和全因死亡的关系。结果病例组的外周血单核细胞的TLR-4、NF-κB和MyD88水平均显著高于对照组(均P<0.05)；不同NYHA分级CHF患者的TLR-4(F=4.026,P=0.032)、NF-κB(F=5.152,P=0.025)和MyD88(F=7.323,P=0.019)水平具有显著差异；随访期间发生全因死亡患者的TLR-4(t=-2.149,P=0.033)和MyD88(t=-2.506,P=0.014)水平显著高于未死亡者；TLR-4作为预测发生全因死亡的灵敏度和特异度分别为83%和77%，而MyD88分别为77%和71%。结论TLR-4信号通路分子与CHF的心功能密切相关，TLR-4和MyD88是潜在的全因死亡预测分子。

Toll样受体4； 慢性心力衰竭； 心功能； 预后

心力衰竭(Heart failure)是由于心脏的收缩功能和(或)舒张功能发生障碍，不能将静脉回心血量充分排出心脏，导致静脉系统血液淤积，动脉系统血液灌注不足，从而引起心脏循环障碍症候群，是心脏疾病发展的终末阶段[1]。慢性心力衰竭(Chronic heart failure,CHF)则为持续存在的心力衰竭状态，此时心肌的病理特征主要表现为神经内分泌的过度激活和心室肌的重塑[2]。研究表明，众多炎症因子和免疫因子在CHF的发生发展中扮演着重要角色，其中Toll样受体信号通路相关分子就被证实与CHF的病理特征密切相关[3]。

Toll样受体4(Toll like receptor 4,TLR-4)分子是近些年发现与多种疾病发生相关的固有免疫系统识别病原相关分子模式的主要受体之一，而且其启动的信号通路还可调节适应性免疫应答[4]。在CHF的研究中，TLR-4被认为参与了该疾病的发生，并且在患者受损的心肌细胞中表达上调，其信号通路上的其它重要分子核转录因子kappa B(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)和髓样分化因子(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)也同样存在改变[5]，但TLR-4、NF-κB和MyD88分子的这种变化是否与CHF患者的病变状态相关尚不明确，本文旨在探讨TLR-4信号通路分子的变化与CHF严重程度和预后的关系，以明确TLR-4信号通路分子用作判断CHF患者病情的可能性。

1 资料与方法

1.1研究对象选择2014年6月～2015年5月期间本院心血管内科和老年科住院病房收治的CHF患者作为病例组。纳入标准：①符合慢性左心室心力衰竭的临床诊断标准[6]；②心功能分级明确；③自愿加入本研究。排除标准：①合并右心室功能受损；②合并感染、免疫系统疾病、肝肾功能不全、恶性肿瘤或精神障碍；③入组4周内服用过非甾体类抗炎药或类固醇激素。根据标准共计纳入117例CHF患者，年龄46～83岁，平均67.6±12.4岁，其中男性68例，女性49例。入院时根据纽约心脏协会(NYHA)心功能分级标准[7]，I级19例、II级27例、III级34例、IV级37例。入院超声心动图检测合并浆膜腔积液者54例、未有积液者63例。基础疾病包括冠心病33例、心脏瓣膜病23例、扩张型心肌病24例、高血压性心脏病17例、其它类型20例，上述病历均采用多种药物联合治疗，包括利尿剂100例、ACEI类药物67例、β受体阻滞剂55例、洋地黄类药物49例。不同心功能分级患者组的年龄、性别、浆膜腔积液和基础疾病类型上的差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。同时选择109例健康体检者作为对照组，年龄47～84岁，平均66.9±11.8岁，其中男性61例，女性48例。病例组和对照组在性别、年龄方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 TLR-4、NF-κB和MyD88检测患者于入院时、健康体检者入组时次日清晨空腹采集肘静脉血20 mL，经相应处理后，应用本院检验科NAVIOS流式细胞仪(Becton Dickinson Co.,Ltd.,US)检测外周血单核细胞中TLR-4、NF-κB和MyD88蛋白的表达情况。主要试剂为藻红蛋白标记的TLR-4单克隆抗体(eBioscience,12991742)、别藻青蛋白标记的NF-κB单克隆抗体(BD Pharmingen,558422)、MyD88多克隆抗体(Abcam,119048)及其相应的同型对照抗体。实验具体操作流程按照标准的试剂说明书进行。

1.3患者随访采用门诊随诊和电话采访等方式对患者进行随访，随访时间3～10个月，中位随访期6个月，终点事件包括心力衰竭再次入院和全因死亡。

1.4统计学分析所有数据管理和处理均在SPSS 18.0软件中进行。计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用t检验或方差分析。计数资料采用例数或百分比表示，组间比较采用卡方检验或Fisher精确检验。TLR-4、NF-κB和MyD88蛋白预测全因死亡的效果采用受试者工作特征曲线(ROC)进行。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CHF患者的TLR-4、NF-κB和MyD88水平变化

病例组的外周血单核细胞的TLR-4、NF-κB和MyD88水平均高于对照组(P均<0.05)，见表1和图1。

表1两组病例的TLR-4、NF-κB和MyD88水平比较(%)

组别nTLR-4NF-κBMyD88病例组1176.17±3.066.20±2.9415.21±7.48对照组1090.91±0.620.33±0.259.76±6.14t17.61020.7725.962P<0.001<0.001<0.001

2.2 TLR-4、NF-κB和MyD88水平与心功能和浆膜腔积液的关系不同NYHA分级CHF患者的TLR-4(F=4.026,P=0.032)、NF-κB(F=5.152,P=0.025)和MyD88(F=7.323,P=0.019)水平比较差异均有统计学意义，但无浆膜积液和有浆膜积液患者的上述三分子水平比较差异无统计学意义(P均>0.05)，见表2。

图1 流式细胞特征图

表2TLR-4、NF-κB和MyD88水平与心功能和浆膜腔积液的关系

心功能nTLR-4(%)NF-κB(%)MyD88(%)NYHA分级 Ⅰ级194.58±1.064.17±1.0912.18±3.29 Ⅱ级275.66±1.125.42±0.9614.20±4.37 Ⅲ级346.45±1.546.73±1.3215.34±4.25 Ⅳ级377.10±1.617.32±1.4417.38±5.02F4.0265.1527.323P0.0320.0250.019浆膜腔积液 无积液636.01±1.226.21±2.3014.95±4.24 有积液546.36±1.076.19±2.3515.51±5.06t-1.6210.050-0.655P0.1080.9600.514

2.3 TLR-4、NF-κB和MyD88水平与预后的关系

非再次入院患者和再次入院患者的TLR-4、NF-κB和MyD88水平比较差异无显著性(P均>0.05)，但在随访期间发生全因死亡的患者其TLR-4(t=-2.149,P=0.033)和MyD88(t=-2.506,P=0.014)水平显著高于未死亡者，见表3。

表3TLR-4、NF-κB和MyD88水平与预后的关系

预后nTLR-4(%)NF-κB(%)MyD88(%)再入院者 否956.06±1.846.11±2.5315.11±6.24 是226.65±0.986.59±1.8215.64±3.00t-1.441-0.837-0.389P0.1520.4040.698全因死亡 存活1126.07±2.426.12±2.5314.87±7.06 死亡58.41±0.787.99±1.0222.83±2.04t-2.149-1.643-2.506P0.0330.1030.014

2.4 TLR-4和MyD88预测全因死亡的效果发生全因死亡的患者和未死亡的患者其外周血单核细胞表达TLR-4和MyD88水平差异显著，因此考虑将该分子作为判断患者是否发生全因死亡的预测分子，由ROC曲线分析可知，TLR-4作为预测分子的灵敏度和特异度为83%和77%，而MyD88的灵敏度和特异度分别为77%和71%，见表4、图2。

表4TLR-4和MyD88预测全因死亡的效果

分子曲线下面积95%置信区间截断值灵敏度特异性TLR-40.7770.671to0.8837.860.830.77MyD880.7900.685to0.89519.260.770.71

图2 ROC曲线图

3 讨 论

研究表明Toll样受体同时表达与免疫细胞和心肌细胞，介导了各种急性心肌损伤和慢性心脏病的发生发展，如心肌缺血的再灌装损伤、心力衰竭的心肌重塑等[8]。本文探讨了其家族中的知名分子TLR-4信号通路与CHF临床特征的关系，发现TLR-4信号通路上的分子包括受体本身、NF-κB和MyD88均与患者的心功能分级密切相关，心功能越差者，其外周血单核细胞中的上述信号分子的表达率越高，但它的表达与患者是否存在浆膜腔积液无关，此外研究还发现TLR-4和MyD88与患者随访期间是否发生全因死亡相关，高比例表达者，更易发生死亡，因此研究进一步分析了这两种分子作为预测患者是否可能发生全因死亡的预测分子，结果显示其灵敏度和特异度均在70%以上，而大于70%是临床对于诊断指标可接受的范围。

关于TLR-4信号通路与心脏疾病的关系研究已有一些报道，关注的焦点最集中在发病率较高的心肌缺血性疾病，大多数研究都认为包括冠心病在内的心肌缺血性疾病都存在外周血单核细胞TLR-4及其相关分子的表达上调，而这种增高与疾病的严重程度密切相关，并且这种升高也与炎性介质TNF和IL-6等相关[9-10]。而动物研究表明TLR-4基因敲除的小鼠，其心肌缺血损伤表现更轻，并且使心肌缺血模型小鼠服用TLR-4抑制剂后，病灶会有所好转[11-12]。这些研究都直接指明TLR-4信号通路在心血管疾病发生发展中的重要角色。对于心力衰竭，多项研究都认为NF-κB可以客观反映该疾病的心功能情况，并且可考虑用于评价心衰的严重程度[13-14]，该结果与本研究的结论一致，但是本研究还分析了TLR-4和MyD88分子，不仅发现它们与心力衰竭的心功能密切相关，并且还与全因死亡密切相关，而目前暂缺乏其它报道对该结论的证实。

综上所述，本研究结果认为TLR-4信号通路分子与CHF的心功能密切相关，TLR-4和MyD88是潜在的全因死亡预测分子，为临床CHF心功能和预后的评价提供了全新的思路。但研究仍然存在不足，一方面由于医院条件有限使得样本量不够充足，另一方面未能完全控制药物使用等混杂因素对结果的干扰。此外，由于疾病谱并不单一、随访时间也有较大差异，这些都可能是结果的潜在影响因素，进一步的研究还应扩大样本量行分层分析。但即便有这些不足之处，研究结果也为临床探讨TLR-4信号通路与CHF的关系提供了重要数据参考。

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TheRelationshipBetweentheToll-likeReceptor4SignalingPathwaysandtheSeverityandPrognosisofPatientswithChronicHeartFailure

CHEN Jinsong,LIU Yunyang,ZENG Gaofeng,et al

(DepartmentofCardiology,theSecondAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo explore the relationship between the Toll-like receptor 4 (TLR-4) signaling pathways and the severity and prognosis of patients with chronic heart failure (CHF).MethodTotal 117 patients with CHF treated during June 2014 to May 2015 and 109 healthy controls were recruited;TLR-4,nuclear factor kappa B (NF-κB) and myeloid differentiation factor (MyD88) expression in peripheral blood mononuclear cells were examined by flow cytometry;the associations of these factors with CHF of NYHA,effusion,readmission,and all-cause mortality were analyzed.ResultsTLR-4,NF-κB and MyD88 in patients group were higher than control group (P<0.05);patients with different NYHA have significantly different TLR-4 (F=4.026,P=0.032),NF-κB (F=5.152,P=0.025) and MyD88 (F=7.323,P=0.019) levels;TLR-4 (t=-2.149,P=0.033) and MyD88 (t=-2.506,P=0.014) in patients who died due to the disease during follow-up were significantly higher than those who had not died;TLR-4 as a predictor of all-cause mortality had sensitivity and specificity of 83% and 77%,while MyD88 had 77% and 71%.ConclusionTLR4 signaling pathway molecules closely related to cardiac function of patients with CHF,TLR-4 and MyD88 may be potential all-cause mortality predictions in that disease.

Toll-like receptor 4; chronic heart failure; cardiac function; prognosis

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.06.012

2016-07-13；

2016-09-28

R541.6

A

蒋湘莲)