miR-218对伊马替尼治疗胃肠道间质瘤的影响

张天宇 赵 敏 王正廷 钟 捷 张晨莉 胡淑榕 程朦朦 林 筠 范 嵘 陈 颖



·临床研究·

miR-218对伊马替尼治疗胃肠道间质瘤的影响

张天宇 赵 敏 王正廷 钟 捷 张晨莉 胡淑榕 程朦朦 林 筠 范 嵘 陈 颖

胃肠道间质瘤(GIST)是消化道中常见的间叶性肿瘤[1]。GIST发病与Ⅲ型酪氨酸激酶受体c-Kit/PDGFRα的异常激活有关[2]。伊马替尼为小分子酪氨酸激酶抑制剂，对预防和治疗GIST术后复发及转移具有确切疗效，可使GIST术后临床获益率达到84%[3]。然而，一部分初期对伊马替尼敏感的患者可能在后续治疗中出现耐药性，40%～50%的GIST患者在治疗开始后2年左右会发生继发性耐药[4-5]。

微小RNA(miRNA)是一类细胞内非编码内源性的单链小分子RNA，通过在转录后水平调节靶基因，进而参与细胞增殖、代谢、凋亡、分化、发育等正常的生理过程，或参与心血管疾病、神经系统疾病、肿瘤疾病等病理过程[6-7]。有研究报道，miR-218可以通过调节靶基因，从而抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移[8-9]。本课题组前期的研究表明，miR-218在人GIST细胞系中的表达下调，可抑制人GIST细胞增殖和侵袭[10]。miR-218与GIST细胞化学治疗敏感性的关系尚未见报道。本研究主要探讨miR-218与GIST细胞对伊马替尼敏感性的关系及作用信号通路，为GIST的治疗提供新方法和新策略。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

TaqManmiRNAIsolationKit及TaqManmicroRNAAssayKit购于AppliedBiosystems公司。miR-218mimic、阴性对照及miR-218inhibitor由上海吉玛制药技术有限公司提供合成。GIST细胞株GIST882(对伊马替尼敏感)及GIST430(对伊马替尼耐药)购自美国模式菌种收集中心(ATCC)。伊马替尼购自瑞士诺华公司。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)通路抑制剂Wortmannin购自美国Axxora公司。兔源性抗人Akt多克隆抗体及兔源性抗人p-Akt多克隆抗体购自美国细胞信号技术公司。

1.2 检测miR-218在GIST882和GIST430细胞株中的表达情况

正常培养的GIST细胞株GIST882或GIST430，进行miR-218mimic、阴性对照和miR-218inhibitor的转染，同时设正常对照组。采用逆转录定量PCR(qRT-PCR)方法检测在GIST细胞株GIST882和GIST430中miR-218的表达。收集体外培养的2种GIST细胞，提取总RNA，检测成熟miR-218的表达，以U6作为内参基因。所有反应均设立3个复孔。记录每个反应管中标本的CT值，实验结果采用qRT-PCR中的相对定量法进行分析。

1.3MTT分析法检测miR-218的异位表达对伊马替尼诱导的GIST细胞的细胞活力的影响

正常培养的GIST882细胞和GIST430细胞，转染miR-218mimic、阴性对照或miR-218inhibitor，同时设正常对照组。采用TaqManmiRNA分离试剂盒分别提取各组细胞的RNA，采用qRT-PCR方法检测GIST882细胞和GIST430细胞中miR-218的表达变化。

在GIST882细胞中转染miR-218inhibitor和阴性对照，在GIST430细胞中转染miR-218mimic和阴性对照。转染后在GIST882细胞或GIST430细胞中加入伊马替尼(终浓度为1.0μmol/L)。

1.4 流式细胞仪分析法检测miR-218的异位表达对伊马替尼诱导的GIST细胞凋亡的影响

在GIST882细胞中转染miR-218inhibitor和阴性对照，在GIST430细胞中转染miR-218mimic和阴性对照。转染后在GIST882或GIST430细胞中加入伊马替尼(终浓度为1.0μmol/L)。加入AnnexinⅤ-FITC和PI染液，流式细胞仪分析检测，FCMCellQuest软件计数细胞，Macquit软件分析数据。

1.5miR-218异位表达对伊马替尼诱导的GIST细胞凋亡的信号通路的影响

在GIST430细胞中转染miR-218mimic和阴性对照，转染后在GIST430细胞中加入伊马替尼(终浓度为1.0μmol/L)。然后，在转染后GIST430细胞中加入PI3K通路抑制剂Wortmannin(终浓度为5μmol/L)，同时设正常对照组。收集各组细胞蛋白，进行电泳分离，分别加入Akt、p-Akt一抗(1∶500稀释)及小鼠抗人β-actin单克隆抗体(1∶1000稀释)，然后加入IRDye800相应标记的二抗(1∶2000稀释于PBS)，Odyssey红外激光成像系统扫膜。采用QuantityOne软件分析p-Akt/Akt灰度比值。

采用流式细胞仪分析PI3K通路抑制剂Wortmannin对miR-218的异位表达，对于伊马替尼诱导的GIST430细胞凋亡的影响。

1.6 统计分析

采用SPSS17.0统计分析软件对实验数据进行统计学处理，两组比较采用t检验，两组以上数据比较采用方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1miR-218在GIST882和GIST430细胞株中的表达情况

qRT-PCR结果显示，miR-218在GIST430细胞中的表达显著低于GIST882细胞，且差异具有统计学意义(P<0.01)。见图1。

图1 GIST430细胞和GIST882细胞中miR-218的表达情况

2.2 miR-218的异位表达对伊马替尼诱导的GIST细胞的细胞活力的影响

本研究在GIST882细胞中转染miR-218 mimic，过表达miR-218；或转染miR-218 inhibitor，抑制miR-218的表达。结果显示，miR-218 mimic转染组中miR-218的表达显著高于正常对照组以及阴性对照组，差异均具有统计学意义(P<0.01)。在miR-218 inhibitor转染组中，miR-218的表达显著低于正常对照组以及阴性对照组，差异均具有统计学意义(P<0.01)。见图2。

图2 GIST882细胞中转染miR-218 inhibitor或miR-218 mimic对miR-218表达的影响

MTT分析显示，在GIST882细胞中转染miR-218 inhibitor，并在1.0 μmol/L的伊马替尼作用下48 h，miR-218 inhibitor转染组的细胞活力明显高于阴性对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)。然而在GIST430细胞中转染miR-218 mimic，在1.0 μmol/L的伊马替尼作用下48 h，miR-218 mimic转染组中的细胞活力低于阴性对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)。见图3。

图3 miR-218的异位表达对伊马替尼诱导的GIST细胞的细胞活力的影响

2.3 miR-218的异位表达对伊马替尼诱导的GIST细胞凋亡的影响

流式细胞仪分析显示，GIST882细胞中转染miR-218 inhibitor，并在1.0 μmol/L的伊马替尼作用下48 h，miR-218 inhibitor转染组的细胞凋亡数明显低于阴性对照组，且差异具有统计学意义(P<0.05)；而在GIST430细胞中转染miR-218 mimic，在1.0 μmol/L的伊马替尼作用下48 h，miR-218 mimic转染组中细胞凋亡数明显高于阴性对照组，且差异具有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 miR-218的异位表达对伊马替尼诱导的GIST细胞凋亡的影响

2.4 miR-218异位表达对伊马替尼诱导的GIST细胞凋亡作用的信号通路

流式细胞仪分析显示，在GIST430细胞中转染miR-218 mimic，在1.0 μmol/L的伊马替尼和5 μmol/L Wortmannin作用下，GIST430细胞的凋亡数显著高于正常对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)。见图5。

图5 两组GIST430细胞凋亡情况的比较

Western blot结果显示，在GIST430细胞中转染miR-218 mimic，在1.0 μmol/L的伊马替尼作用下48 h，miR-218 mimic转染组中p-Akt/Akt的比值显著低于正常对照组，且差异具有统计学意义(P<0.01)。见图6。

图6 各组GIST430细胞中p-Akt、Akt和β-actin蛋白的表达情况

3 讨论

目前有关miRNA与肿瘤化学治疗敏感性之间关系的研究，正逐渐受到学者们的重视，已成为近年来的研究热点。本研究结果显示，miR-218的过表达可增强GIST430细胞对伊马替尼的敏感性，抑制miR-218的表达，可降低GIST882细胞对伊马替尼的敏感性。因此，本研究采用PI3K通路抑制剂Wortmannin以探讨miR-218作用的信号通路。

PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶[11]，ⅠA型PI3K与受体酪氨酸激酶(RTK)途径密切相关，其中调节亚基p85发挥了关键作用。PI3K的活性在所有与RTK相关的肿瘤中都有所上升，并被RTK直接调控。有效的RTK抑制剂必须对PI3K通路产生有效的抑制作用[12]。在部分肿瘤中，多种RTK与PI3K通路同时存在，此类肿瘤可能会形成对单一靶点RTK抑制剂的抵抗[13]。PI3K/Akt通路作为c-Kit的下游，也是通过调节亚基p85作用的。Blume-Jensen等[14]通过体内及体外实验证实，c-Kit(Tyr719)磷酸化后可以与PI3K的调节亚基p85结合，激活经典的PI3K/Akt通路。对伊马替尼敏感的GIST患者，在使用伊马替尼治疗过程中，这条通路显著被抑制[15]。当GIST细胞产生伊马替尼耐药后，c-Kit基因发生二次突变，c-Kit大量扩增，PI3K/Akt通路将会被重新激活[16]。本研究通过应用PI3K通路抑制剂Wortmannin，证实了过表达miR-218可增强GIST430细胞对伊马替尼的敏感性，其作用可能是通过PI3K/Akt信号通路实现的。

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(本文编辑：周骏)

上海交通大学医学院科技基金项目(14XJ10014)

200025 上海交通大学医学院附属瑞金医院消化内科(张天宇，王正廷，钟捷，张晨莉，胡淑榕，程朦朦，林筠，范嵘，陈颖)，检验科(赵敏)

范嵘，Email:fanrong-fr@hotmail.com；陈颖，Email:welcomecy@sina.com

10.3969/j.issn.1673-534X.2016.05.015

2016-04-15)