螯合剂对镁基骨水泥体外细胞毒性的影响

张 莉，杨在君 ，丁 祥，康泰然，彭正松，黎云祥，杨 军，彭红卫,2，廖咏梅

(1.西华师范大学 组织修复材料工程技术协同创新中心，四川 南充 637009；2.成都达普医疗器械有限公司，成都 610000)



螯合剂对镁基骨水泥体外细胞毒性的影响

张 莉1，杨在君1，丁 祥1，康泰然1，彭正松1，黎云祥1，杨 军1，彭红卫1,2，廖咏梅1

(1.西华师范大学 组织修复材料工程技术协同创新中心，四川 南充 637009；2.成都达普医疗器械有限公司，成都 610000)

为提高镁基骨水泥的生物相容性，探讨了螯合剂，如：三聚磷酸钠、六偏磷酸钠、EDTA、L-Cys、L-Lys、L-Arg和L-Glu对镁基骨水泥体外细胞毒性的影响。同时，研究了主料A(氧化镁和磷酸二氢钾)和辅料B(蔗糖、羟基磷灰石和螯合剂)的加入顺序对镁基骨水泥体外细胞毒性的影响。结果表明，螯合剂的加入可以明显提高细胞的增殖率，其中三聚磷酸钠的效果最为显著，细胞增殖率达到119.6%。主料A和辅料B的加入顺序对镁基骨水泥的体外细胞毒性也有较大的影响。因此，在镁基骨水泥的制备过程中正确的制备方法是：先将主料A与固化液混合，搅拌成浆体后再加入辅料B，继续搅拌均匀后备用。

镁基骨水泥；体外细胞毒性；螯合剂

不稳定骨折、因骨质疏松而引发的骨折一直都是摆在外科医生面前的难题，不仅要求医生高超的手术技能，更依赖于性能优异的骨修复材料[1,2]。目前的治疗方法主要是切开复位内固定术，而与这种手术配合使用的生物医疗材料有钢铁合金、尼龙线、可吸收高分子螺钉等。这些材料都存在一定的不足和不同程度的异物反应，甚至使用后期会释放有毒有害物质，需要二次手术取出内固定物。为了克服这种二次手术带给病人的痛苦和经济负担，加快病人的骨愈合，骨修复材料领域迫切需要一种在人体内可降解、粘结性好、强度高的骨粘合材料。

目前，市面上的骨填充材料主要为磷酸钙基填料和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。磷酸钙基填料虽具有较好的生物相容性，但由于具有较高的钙磷比，使得它们的体内降解性较差。同时，磷酸钙基填料在凝固时不会膨胀，不具有粘接功能，因此不适用于韧带之类的软组织与骨的连接[3]。PMMA具有较强的粘接能力，但它属于惰性的硬化聚合物，不具有降解性和促进新骨生长的功能。况且，PMMA在固化过程中放出大量的热，从而导致周围细胞死亡。

磷酸镁水泥(MPC)具有早期强度高、凝固时间短、耐磨性好等优异性能，主要用于机场、道路的抢修、核废料的固化以及近几年才出现的受损骨的修复[4]。这种骨修复材料具有和磷酸钙骨水泥一样的生物相容性，能够诱导骨再生，经适当改性后具有很高的强度，可作为牙科修复材料，对矿质表面、金属表面具有很强的粘附力，亦可作为骨粘合修复材料，是近年生物无机水泥领域研究的热点[5]。目前研究较多的是采用磷酸二氢氨的铵盐型镁基骨水泥[6,7]。但是，铵盐型镁基骨水泥在制作过程中会产生刺激性的氨气，造成环境污染。同时，铵盐型骨水泥在体内也会释放出氨气，对细胞具有毒害作用，导致生物相容性相对较差[8]。除铵盐型镁基骨水泥外，2009年美国FDA批准了一个采用磷酸二氢钾的钾盐型镁基骨水泥。近年来，国内有些学者对钾盐型镁基骨水泥进行了改进，如中国专利CN 102488921 A公开了一种提高钾盐型镁基水泥生物相容性的助剂，它是采用葡萄糖酸钠或维生素C糖苷、甘露醇、山梨醇或木糖醇，或甘露醇、山梨醇、木糖醇、氨基酸作为金属离子螯合剂，将氧化镁、磷酸盐、羟基磷灰石、硫酸钙、金属离子螯合剂等粉体直接与水混合，搅拌成膏体状泥[9]。然而笔者对上述钾盐型镁基骨水泥进行了一系列实验，发现这些骨水泥或多或少的具有一定的细胞毒性。其原因主要是磷酸盐和氧化镁未能完全反应，游离出较高浓度的K+和Mg2+离子，从而造成细胞的死亡。

1 材料与方法

1.1 细胞株及培养基

本实验所用细胞株为L929细胞株(中科院上海细胞所)。细胞培养基为MEM培养基(HYCLONE公司)，胎牛血清(GIBCO公司)，MTT(SIGMA公司)。

1.2 镁基骨水泥粉体和固化液

粉体分为两部分，即主料A和辅料B。主料A包括43%的氧化镁和43%的磷酸二氢钾(粉体总的质量百分比)。氧化镁使用前1 600℃煅烧4h，然后随炉冷却。辅料B包括4%的蔗糖，8%的羟基磷灰石和2%的金属螯合剂。螯合剂的种类为：三聚磷酸钠、六偏磷酸钠、EDTA、L-Cys、L-Lys、L-Arg和L-Glu。以专利CN10176344A中的所述的一个实施例为对照，即：45%氧化镁，45%磷酸二氢钾，8%的羟基磷灰石和2%的蔗糖[10]。所有粉体成份均利用球磨仪研磨后过300目的尼龙筛。固化液为5%的磷酸溶液。粉体使用25KGy的辐照灭菌，固化液使用121℃湿热灭菌30min。

1.3 镁基骨水泥的制备

按照粉体总比例10∶3(质量体积比，g/mL)将主料A与固化液混合，搅拌成浆体状，然后加入辅料B继续搅拌均匀，供注射或直接使用。为了比较主料A和辅料B加入顺序对体外细胞毒性的影响，将A和B混合后再加入固化液搅拌成浆体供注射或直接使用。对照组将粉体和固化液混合后搅拌成浆体使用。

1.4 体外细胞毒性检测

阴性对照为高密度聚乙烯，阳性对照为有机稳定剂聚氯乙烯。将1.3中制备的样品浆体灌装入5mL注射器中，注射入预装有5mL细胞培养液的离心管中，根据注射的质量，调整细胞培养液的量至浸提浓度为0.2g/mL。阴性对照和阳性对照均按0.2g/mL的比例浸提。浸提24h，浸提条件为37±1℃。

体外细胞毒性检测参照GB/T16886.5—2003中的标准执行。将配置好的2×104/mL细胞悬液接种于96孔培养板，设置空白、阴性、阳性对照组和实验组，每组6孔，每孔接种100μL细胞悬液。置于CO2培养箱中培养(含体积分数5%的CO2气体)37℃培养24h后，弃去原培养液。空白对照组加入新鲜细胞培养液，阴性和阳性对照组分别加入阴性和阳性浸提液，实验组加入实验样品浸提液。每孔100μL，置于CO2培养箱中继续培养。24h后每孔加入5g/L的MTT溶液20μL，继续培养4h后弃去孔内液体，加入150μL DMSO，置于震荡器上震荡10min，在酶标仪570nm和630nm波长下测定吸光度。通过以下公式计算相对增殖率(RGR)，RGR=(实验组吸光度值/空白对照组吸光度值) ×100%。

2 实验结果

2.1 不同螯合剂对镁基骨水泥的体外细胞毒性影响

含不同螯合剂的镁基骨水泥的体外细胞毒性实验结果如图1(a～h, j为空白对照)和表1。从图1可知，螯合剂的加入不仅能降低细胞的死亡率还能促进细胞的增殖分裂。同时由表1也说明了螯合剂的加入可以明显提高细胞的增殖率，使得镁基骨水泥的细胞毒性达到1级或0级。其中，三聚磷酸钠的效果最为显著，细胞相对增殖率达119.6%，能促进细胞的增殖。而对照组的体外细胞毒性达到3级。

2.2 主料A和辅料B加入顺序对镁基骨水泥体外细胞毒性的影响

以螯合剂三聚磷酸钠为例探讨了主料A和辅料B对镁基骨水泥的体外细胞毒性影响，结果见图1(i)和表2。由表2可见，如将A和B混合后再加入固化液会使细胞增殖率大大降低，从而降低镁基骨水泥的生物相容性。

表1 含不同螯合剂的镁基骨水泥样品的细胞相对增殖率

表2 主料A和辅料B的加入顺序对细胞增殖率的影响

3 讨 论

生物相容性是指材料与生物体之间的相互作用后产生的各种生物、物理、化学等反应。一般地讲，就是材料植入人体后相容程度，即是否对人体组织造成危害。镁基骨水泥中的主要化学反应为：

MgO+KH2PO4+5H2O—MgKPO4·6H2O[11]

因此，在镁基骨水泥的粉体中，主要参与化学反应的为氧化镁和磷酸二氢钾，其它辅料基本不参与反应。而终产物为凝胶物MgKPO4·6H2O及未反应完的氧化镁和磷酸二氢钾。如果该反应不充分将导致机体局部钾离子和镁离子浓度增加，从而导致机体周围细胞坏死，对组织愈合极为不利。解决这一问题主要从两方面入手:(1)优化氧化镁和磷酸二氢钾的比例；(2)优化反应条件。关于第一方面，目前已有较多的研究，如专利CN101076344 A[10]。因此，本研究主要从反应条件进行优化。首先在固化液方面，本研究利用5%的磷酸水溶液(质量体积比)替代传统的水溶液。这样可以增加反应体系中氢离子的浓度，从而促进反应。同时如果氧化镁过量，将会造成组织周围pH值升高带来碱性化，不利于组织修复，而使用一定浓度的酸溶液作为固化液可以调节pH值在7附近，有利于骨骼的生长。其次，为了去除未反应的K+和Mg2+离子，本研究加入了螯合剂，同时调整了主料和辅料的加入顺序。这里所谓的主料包括：氧化镁和磷酸二氢钾；辅料为：蔗糖、羟基磷灰石和螯合剂等。即，将氧化镁和磷酸二氢钾以一定的比例混合后，加入一定量的固化液，搅拌成浆体状，最后加入辅料继续搅拌均匀，供注射或直接使用。这样做的优势体现在以下两方面:(1)该反应的主反应为氧化镁和磷酸二氢钾的酸碱中和反应，可以排除辅料对反应的影响，同时，如将辅料与主料一起加入势必增加粉体的量，而固化液的量是一定的，这样会使搅拌初期液体太少，主料和固化液不能充分接触而使反应不完全;(2)螯合剂的作用是螯合掉多余的钾离子和镁离子，如果将螯合剂和主料一起加入，那么螯合剂在反应前或反应初期就与钾离子和镁离子发生了反应，无法达到预期的目的，而在主反应后加入螯合剂才能真正发挥螯合剂的功能。

本研究中的细胞增值率数据与专利CN101076344A、CN102488921A存在差别，这与试验方法有关；CN101076344A、CN102488921A均为材料凝固24h后再浸提[9,10]。这与材料进入人体的初始状态不符，实际上材料进入人体的初始状态为浆体状，而非固体状。本研究是将浆体直接注射到浸提液中，让其在浸提液中凝固，这更符合材料进入人体的实际情况，其细胞增值率数据也更能说明问题。

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[3] 方彩萍.可注射镁基磷酸钙水泥的研究[D].武汉：武汉理工大学生物中心,2011.

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Cytotoxicity Test of Magnesium Phosphate Bone Cement with Chelating Agent

ZHANG Li1,YANG Zaijun1,DING Xiang1,KANG Tairan1,PENG Zhengsong1,LI Yunxiang1,YANG Ju1,PENG Hongwei1,2,LIAO Yongmei1

(1.Collaboration Innovation Center for Tissue Repair Material Engineering Technology,China West Normal University,Nanchong Sichuan 637009,China;2.Chengdu Medapp Biotech.Co.Ltd,Chengdu 610000,China)

Magnesium phosphate cements (MPC) have properties that are relevant to biomedical applications,such as fast setting,early strength acquisition and adhesive properties.In order to improve the biocompatibility of MPC,the in vitro cytotoxicity of MPC with chelating agent,such as,sodium tripolyphosphate,sodium hexametaphosphate,EDTA,EDTA,L-Cys,L-Lys,L-Arg and L-Glu,was studied in this paper.The effect of different addition sequence of main materials A (magnesium oxide and potassium dihydrogen phosphate) and auxiliary materials B (sucrose,hydroxyapatite and chelating agent) on the in vitro cytotoxicity of MPC was also discussed.The results indicated that the addition of chelating agent in MPC can significantly improve the cell proliferation rate,among them,the effect of sodium tripolyphosphate was the most significant,and the cell proliferation rate reached 119.6%.And the addition sequence of main materials A and auxiliary materials B greatly influences the in vitro cytotoxicity of MPC.Therefore, in the process of preparation of MPC,the correct method is as follows:first mix main materials A and the setting liquid;secondly, stir them into a paste;then add the auxiliary materials B into the paste;last,continue to stir everything evenly.

magnesium phosphate bone cement;in vitro cytotoxicity;chelating agent

1673-5072(2016)03-0270-04

2015-09-05 基金项目：四川省教育厅重大培育项目(14CZ0015) 作者简介：张 莉(1992—)，女，四川达州人，硕士研究生，主要从事功能基因的研究。 通讯作者：杨在君(1981—)，男，四川仪陇人，副教授，主要从事遗传和材料的研究与教学。E-mail:zaijunyang@cwnu.edu.cn

R318

A

10.16246/j.issn.1673-5072.2016.03.007