促红细胞生成素后处理减轻大鼠再灌注损伤肺细胞凋亡中的作用及机制

金晓盛 许先荣 李国平 金前 陈海娥 邵美琴

促红细胞生成素后处理减轻大鼠再灌注损伤肺细胞凋亡中的作用及机制

金晓盛 许先荣 李国平 金前 陈海娥 邵美琴

目的 探讨促红细胞生成素后处理在减轻肺缺血/再灌注损伤（LIRI）大鼠肺细胞凋亡中的作用及其机制。方法 健康雄性成年SD大鼠40只，按随机数字表法分成5组，每组8只，即假手术对照组（C组）、缺血/再灌注(IR)组、促红细胞生成素（EPO）组、EPO+溶剂对照组（PPCES溶液）（P组）和EPO+SP600125（SP组），通过阻断左肺门制作动物模型并予相应处理。原位末端标记法（TUNEL）检测肺细胞凋亡情况并计算凋亡指数（AI）；RT-PCR法、免疫组化法测定肺组织Bcl-2、Bax基因和蛋白的表达；光镜下观察肺组织的病理变化及测定肺泡损伤数（IQA）。结果 与C组比较,IR组肺组织IQA显著升高，AI显著升高，Bcl-2基因和蛋白表达明显下降，Bax基因和蛋白表达明显上调，Bcl-2/Bax的比值降低（均P＜0.05），肺组织形态学发生异常改变；与IR组比较，EPO组、P组、SP组的IQA显著降低，AI显著降低，Bcl-2基因和蛋白表达上调，Bax基因和蛋白和表达下降，Bcl-2/Bax的比值增高（均P＜0.05），肺组织形态学结构异常改变有所减轻；与EPO组比较，SP组的IQA降低，AI显著降低，Bcl-2基因和蛋白表达上调，Bax基因和蛋白表达下降，Bcl-2/Bax的比值增高（均P＜0.05），SP组的肺组织形态学结构损伤较EPO组减轻。结论 EPO后处理能减轻LIRI，其机制可能通过抑制JNK信号转导通路的激活，上调凋亡抑制因子Bcl-2的表达，下调促凋亡基因Bax的表达，提高Bcl-2/Bax比值，使肺组织细胞凋亡减少，改善其结构。

促红细胞生成素 后处理 再灌注损伤 肺 细胞凋亡

近年来，随着医学科学的迅猛发展，肺动脉袖状切除、肺移植、体外循环手术、肺溶栓治疗等新的医疗技术不断地建立，但肺缺血/再灌注损伤（lung ischemia reperfusion injury，LIRI）仍是早期高发病率、高病死率的主要原因，也是手术失败的重要原因之一。C-Jun氨基末端激酶（C-Jun N-terminal Kinase，JNK）是丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）家族的重要成员，其介导体内多种内源性信号转导途径，在某些因子、紫外线、DNA损伤因子等刺激作用下可被强烈激活[1]。已有大量研究表明，JNK在心、肝缺血/再灌注（ischemia reperfusion，IR）中被激活，引起组织损伤和细胞凋亡。促红细胞生成素（EPO）是一种肾脏分泌的酸性糖蛋白类激素，可选择性地刺激骨髓中造血干细胞增生分化，促进成熟红细胞的生成。研究证实EPO对心、肝、肾、小肠、脑等脏器的缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）提供组织保护作用[2]。本实验意在探讨EPO后处理对肺IR是否有保护作用，以期为临床减轻LIRI提供理论基础，改善肺切除及肺移植等患者的预后。

1 材料和方法

1.1 材料 健康雄性成年SD大鼠40只，体重200～250g；由温州医科大学动物实验中心提供，实验动物使用许可证号：SCXK（2010-0150），动物实验方案经温州医科大学实验动物伦理委员会审核并同意实施。Trizol购自美国invitrogen公司，PCR Mix购自天根生化科技（北京）有限公司，原位凋亡细胞检测TUNEL试剂盒购自瑞士Roche公司，cDNA试剂盒购自美国Fermentas公司，Bax、Bcl-2鼠多克隆抗体购自美国Santa cruz公司，即用型SABC过氧化物酶试剂盒购自武汉博士德公司，EPO购自沈阳三生制药股份有限公司，SP600125购自美国Sigma公司。

1.2 实验分组及动物模型制作 按随机数字表法将40只实验大鼠分为5组，每组8只。（1）假手术对照组（Control，C组）：左肺门游离后留置阻断带,观察2.5h；（2）IR组：阻断左肺门30min后开放再灌注2h；（3）EPO组：左肺门于缺血后在再灌注开始时予以尾静脉注射外源性EPO 3 000U/kg，其余处理同I/R组；（4）EPO+溶剂对照组（PPCES溶液，即30%聚乙二醇+20%聚丙烯乙二醇+15%聚氧乙烯蓖麻油+5%乙醇+30%0.9%氯化钠溶液）（P组）：缺血前给予7.5ml/kg体重的PPCES溶液，余同EPO组；（5）EPO+SP600125组（SP组）：SP600125为JNK的特异性抑制剂，缺血前尾静脉注射10mg/kg SP600125溶液（10mg SP600125溶于7.5mlPPCES溶液），余同EPO组。

1.3 动物模型复制 按照已发表文献复制大鼠原位肺IR模型[3]。40只实验大鼠腹腔内注射5%水合氯醛（0.7ml/100g），麻醉后行气管切开插管，接动物呼吸机，行机械通气。取颈前正中切口，暴露分离出右侧颈动脉和气管。沿左胸骨暴露胸腔及左肺门，穿过阻断带，当静息5min后，在呼气末用阻断线阻断左肺门，于30min后开放，然后予以再灌注120min。

1.4 光学显微镜下病理形态学观察 从40只大鼠左肺中分别取1.5cm×1.5cm×1.5cm的肺组织，0.9%氯化钠溶液冲洗干净，浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，24h后脱水，常规石蜡包埋，切片，厚度约5μm，HE染色，普通光学显微镜下观察各组肺组织的形态学改变。

1.5 肺泡损伤数测定 在200倍视野的光镜下连续观察20个视野，计算损伤肺泡数占计数肺泡总数百分比（按Murata方法[4]：肺泡内含红细胞和白细胞超过2个以上的损伤肺泡数占总计肺泡数的百分比），即肺泡损伤数比值（IQA），作为肺泡损伤的定量评价指标。

1.6 原位末端标记（TUNEL）法测定肺组织细胞凋亡依据文献[5]，采用Roche公司提供的试剂盒说明书所述方法进行操作。凋亡细胞核经DAB染色呈棕褐色，未凋亡细胞胞核复染后呈蓝紫色。计算5个高倍视野（×400）下的凋亡细胞数和细胞总数。每张片子至少观察500个细胞，计数每100个细胞内的阳性细胞，即凋亡指数（apoptosis index，AI）。

1.7 免疫组织化学（SABC法）的方法测定肺组织Bcl-2、Bax蛋白的表达水平 按照试剂盒所提供的说明书和文献[6]中所述步骤进行操作。标本上呈棕褐色显色的部分为Bcl-2、Bax蛋白阳性表达。采用美国IPP6.0彩色图像分析系统测定阳性部位及背景的光密度（optical density，OD）值，以阳性部位的光密度值减背景的光密度值代表阳性部位的OD值。

1.8 RT-PCR法检测肺组织Bcl-2、Bax基因的表达Trizol法提取肺组织总RNA，逆转录cDNA的过程参照试剂说明书进行。PCR反应体积25μl：模板cDNA1μl，上下游引物各1μl，PCRmix12.5μl，加双蒸水至25μl。反应条件：94℃变性3min，然后以94℃30s，退火Bcl-2为61.6℃30s，Bax为55℃30s，延伸72℃1min，循环次数：Bcl-2为33次，Bax为30次，最后72℃5min。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCT产物，溴乙锭显色，用凝胶成像分析仪紫外灯进行摄像分析，灰度扫瞄，用gelpro analyze分析软件分析电泳图，用内参β-actin的灰度值校正计算Bcl-2或Bax基因的相对含量。

1.9 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件，计量资料均采用表示；多组样本均数比较进行方差齐性检验，方差齐性者多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，方差不齐者进行Dunnet′s t检验。双变量的相关性分析采用Bivariate过程的Pearson相关分析法。

2 结果

2.1 光镜下肺组织形态学的变化 C组：肺间质及肺泡细胞结构保持完整，未见明显炎性细胞及红细胞浸润。IR组：肺间质增宽水肿，炎症细胞浸润，肺泡内可见较多红细胞渗出，偶可见肺部实性变，损伤明显。EPO组、P组：与IR组比较，肺组织细胞损伤明显减轻，肺间质水肿减轻，肺泡内红细胞渗出减少，炎症细胞聚集减少。SP组：肺组织细胞损伤较EPO组减轻，肺间质水肿减轻，少量炎症细胞及红细胞浸润。详见图1。

图1 各组大鼠左肺组织光镜下形态学改变（HE染色，×100）

2.2 5组大鼠肺组织IQA、AI和Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax 蛋白及基因的比较 见表1。

表1 5组大鼠肺组织IQA、AI和Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax蛋白及基因的比较（n=8）

由表1可见，与C组比较，IR组IQA显著升高（P＜0.05）；与IR组相比，EPO组、P组、SP组的IQA显著降低（均P＜0.05）；与EPO组比较，SP组的IQA显著降低（P＜0.05）。

图2 TUNEL法示各组肺组织细胞凋亡情况（DAB染色，×400）

IR组AI显著高于C组（P＜0.05），EPO组、P组、SP组AI显著低于IR组（均P＜0.05），SP组的AI值显著低于EPO组（P＜0.05）（图2）。与C组比较，IR组Bcl-2基因及蛋白表达明显下降，Bax明显上调，同时Bcl-2/ Bax的比值降低（均P＜0.05）；与IR组相比，EPO组、P组、SP组Bcl-2基因及蛋白表达增强，Bax表达减弱，Bcl-2/Bax的比值增高（均P＜0.05）；与EPO组比较，SP组Bcl-2基因及蛋白表达上调，Bax下降，同时Bcl-2/Bax的比值升高（均P＜0.05）（图3-4）。

图3 免疫组化法示各组织Bcl-2蛋白表达水平（DAB染色，×200）

图4 免疫组化法示各组织Bax蛋白表达水平（DAB染色，×200）

2.3 相关性分析 肺组织细胞AI与IQA呈正相关（r= 0.968，P＜0.01），与Bcl-2/Bax蛋白比值呈负相关（r= -0.869，P＜0.01），与Bcl-2/Bax基因比值呈负相关（r= -0.745，P＜0.01）。

3 讨论

细胞凋亡又被称为程序化细胞死亡，是细胞接受某种信号后或受到某些因素刺激后的一种主动的，由一些凋亡相关基因相互作用的细胞死亡过程。近年来，国内外学者的大量研究发现，细胞凋亡参与了LIRI[7]。本实验中，IR组AI较C组明显升高，IQA较C组升高，肺组织损伤较C组严重，这些充分证明细胞凋亡可能是肺IR的机制。

Ng等[7]报道，触发细胞凋亡的途径主要有死亡受体途径（外源性途径）和线粒体-细胞色素C（cytochrome c，Cyt-c）途径（内源性途径）。其中外源性途径通过特定的受体-配体相互作用，比如Fas/Fas-L、血管紧张素Ⅱ和TNF/受体，导致一系列的细胞内凋亡级联激活主要是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspases）；内源性途径主要是通过Bcl-2家族基因中的促凋亡基因Bax作用于线粒体膜表面，使其通透性改变，Cyt-c和凋亡蛋白酶激活因子（Apaf）释放，凋亡小体形成，激活caspases家族，导致细胞凋亡的发生。细胞凋亡与否主要是细胞内的促凋亡基因Bax和抑制凋亡基因Bcl-2相互作用，Bcl-2占优势时细胞存活，Bax占优势时细胞走向凋亡[8-9]。实验结果显示：肺IR时，Bcl-2基因及蛋白表达下降，Bax基因及蛋白表达均升高，且Bcl-2/Bax比值下降；AI与Bcl-2/Bax基因及蛋白表达呈负相关，这与文献报道一致[10]；而肺EPO组中，Bcl-2基因及蛋白表达上调，Bax基因及蛋白表达下降，AI减少，光镜下显示肺组织结构损伤减轻，IQA值降低，结果表明了肺EPO后处理可减轻肺IR的细胞损伤和细胞凋亡。

随着近年来对细胞信号转导研究的日益加深，MAPKs家族对调控细胞凋亡的作用受到日益重视。MAPKs家族是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。更多的研究表明MAPKs家族在肺IR及其所致的细胞凋亡中发挥了不可忽视的作用[11-12]。JNK是MAPKs家族重要的成员，已有研究表明其参与了多种组织器官的IR损伤[13]。SP600125为JNK特异性抑制剂，在心脏IR时应用SP600125可以减轻IR引起的组织损伤和细胞凋亡[14]。本实验结果发现，联合应用EPO和SP600125后，肺组织AI值降低，抗凋亡基因Bcl-2占优势，肺组织损伤和凋亡细胞数减少，即SP600125增强了EPO对肺IR的保护作用。这充分说明了EPO很可能是通过抑制JNK来对肺IR进行保护的。

综上所述，EPO后处理对IR引起的肺损伤具有保护作用，可能与其抑制JNK信号转导通路的激活，上调凋亡抑制因子Bcl-2的表达，下调促凋亡基因Bax的表达，提高Bcl-2/Bax比值来抑制细胞凋亡有关。

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Erythropoietin postconditioning attenuates pneumocyte apoptosis after lung ischemia/reperfusion in rats

JIN Xiaosheng,XU Xianrong, LI Guoping,et al. Department of Respiratory Medicine,Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou 310012,China

Objective To investigate the effects oferythropoietin (EPO)postconditioning on pneumocyte apoptosis in lung ischemia/reperfusion injury(LIRI)of rats and its mechanisms. Methods Adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 5 groups(n=8 in each group):control group(C),Lung ischemia/reperfusion group(IR),EPO+IR group(EPO),EPO+solvent control group(P),EPO+SP600125 group(SP).At the end of experiments the animals were sacrificed and lung samples were collected.The apoptosis index(AI)of pneumocytes was measured by terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end abeling(TUNEL)method;the expressions of Bcl-2 and Bax mRNA and proteins were measured by RT-PCR and quantitative immunohistochemistry,respectively.The pathologicalchanges of lung tissue were observed under light microscope and the index ofquantitative assessment(IQA)ofhistologicallung injury was counted. Results Compared with C group,IQA and AIin IR group were increased,the expression ofBcl-2 was decreased,the expression ofBax was increased and Bcl-2/Bax was decreased(P＜0.05);there were abnormal morphological changes under the light microscope.Compared with IR group,IQA and AI were decreased in EPO,P and SP groups,the expression of Bcl-2 was increased,Bax was decreased and Bcl-2/Bax was increased (P＜0.05);the morphological changes markedly reversed in EPO,P and SP groups.There were no significant differences in all indexes between P and EPO groups(P＞0.05).Compared with EPO group,IQA and AI of SP group were decreased,the expression of Bcl-2 was increased,Bax was decreased and Bcl-2/Bax was increased(P＜0.05);the abnormal morphological changes in SP group were milder than those in EPO group. Conclusion Erythropoietin postconditioning may attenuate pneumocyte apoptosis in lung ischemic/reperfusion injury by inhibiting activation of JNK signal transduction pathway,andup-regulating Bcl-2 expression and down-regulating Bax expression.

Erythropoietin Postconditioning Reperfusion injury Lung Apoptosis

2015-09-14）

（本文编辑：沈昱平）

浙江省中医药重点学科建设计划项目（2012-XK-A28）；温州市科技计划项目（Y20120001）

310012 杭州，浙江省立同德医院呼吸内科（金晓盛、许先荣、李国平、金前）；温州医科大学缺血-再灌注损伤研究所（陈海娥）；温州市人民医院呼吸内科（邵美琴）

金晓盛，E-mail：jxs19791109@163.com