罗布麻叶总黄酮提取物对抑郁模型大鼠抗抑郁作用的研究

王佳 谢健 陈岳明 高力舒 张海生

●论 著

罗布麻叶总黄酮提取物对抑郁模型大鼠抗抑郁作用的研究

王佳 谢健 陈岳明 高力舒 张海生

目的 探讨罗布麻叶（AVL）总黄酮提取物对实验性抑郁大鼠的抗抑郁作用。方法 将105只大鼠随机分为7组，每组15只。正常对照组：仅给予0.9%氯化钠溶液；抑郁模型组：抑郁造模开始时给予0.9%氯化钠溶液；抑郁大鼠AVL总黄酮提取物低、高剂量预防组（40mg/kg、80mg/kg）：抑郁造模前1周灌胃给予相应剂量的药物，直至造模结束；抑郁大鼠AVL总黄酮提取物低、高剂量治疗组（40mg/kg、80mg/kg）：于抑郁造模后1周灌胃给予相应剂量的药物，直至造模结束；抑郁大鼠氟西汀治疗组（20mg/kg）：抑郁造模后1周予灌胃给药，直至造模结束。采用慢性不可预知性轻度应激（CUMS）方法建立抑郁模型。观察应激前后各组大鼠矿场实验垂直运动次数及水平运动总路程的差异；液质联检分析各组大鼠在应激前后脑内海马及前额叶皮层单胺类神经递质，包括去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）和5-羟色胺（5-HT）水平的变化。结果 与正常对照组相比，抑郁模型组大鼠在旷场实验中的垂直运动次数及水平运动总路程均明显减少（均P＜0.01）；与抑郁模型组比较，氟西汀组垂直运动次数及水平运动总路程均明显增加（均P＜0.01）；AVL总黄酮提取物预防和治疗各组，与抑郁模型组相比，垂直运动次数及水平运动总路程均有增加，尤以高剂量预防组增加最为明显（P＜0.01）。与正常对照组相比，抑郁模型组在大鼠海马组织及前额叶皮层均有DA、NE、5-HT水平下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；氟西汀组与抑郁模型组比较，海马组织DA、5-HT水平明显增高（P＜0.01），前额叶皮层DA、NE、5-HT水平均增高（均P＜0.05或0.01）；AVL总黄酮提取物高剂量预防组与抑郁模型组比较，海马组织5-HT水平增高（均P＜0.01），前额叶皮层DA、NE、5-HT水平均增高（均P＜0.05）。结论 AVL总黄酮提取物具有抗大鼠抑郁作用，有剂量-效应关系，高剂量预防组抗抑郁效应与氟西汀治疗组相似，可能通过提高大鼠海马组织5-HT及前额叶皮层NE、DA、5-HT水平达到抗抑郁作用。

罗布麻叶总黄酮 抑郁 单胺递质

抑郁症发病机制仍不清楚，抗抑郁症治疗的西药主要通过调节脑内突触间隙单胺类神经递质浓度，平衡单胺类神经的功能而发挥治疗效应，但是在治疗中存在反应延迟及有效率低的问题，且不良反应多、价格昂贵、患者对西药服药依从性差等弊端。中药治疗抑郁症具有多靶点、多系统调节优势，成为近年研究热点。罗布麻叶（Apocynum venetum leaves，AVL）为夹竹桃科茶叶花属植物罗布的叶，其作茶饮及药用有悠久的历史，具有清热利水、平肝安神的功能，近年来研究发现其具有良好的抗抑郁活性[1]。然而，目前对于其抗抑郁作用机制尚不清楚。本研究采用慢性不可预知性轻度应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）的方法建立大鼠抑郁模型，以抗抑郁药氟西汀为对照组，比较不同剂量AVL总黄酮提取物对抑郁模型大鼠行为学及对脑内单胺类物质表达水平的影响。

1 材料和方法

1.1 材料 成年Sprague-Dawley（SD）雌性大鼠[SPF级，许可证号：SCXK（湘）2011-0003，湖南斯莱克景达有限公司]105只，体重190～210g。食物与水充足供给，自由摄取，饲养室温度（22±1）℃，相对湿度维持在50%，昼夜节律为12h（光照时间7:00～19:00）。本研究对动物所有的实验操作均遵守中国国家科学技术委员会颁布的中华人民共和国《实验动物管理条例》。盐酸氟西汀分散片（礼来苏州制药有限公司，批号J20120001，规格：20mg/片）；AVL总黄酮提取物（陕西森弗生物技术有限公司，批号：LBM130213），干粉剂，黄酮含量在95%以上。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 105只大鼠随机分为7组，每组15只。正常对照组（A组）：不给予任何刺激，仅给予0.9%氯化钠溶液；抑郁模型组（B组）：抑郁造模开始时给予0.9%氯化钠溶液；抑郁大鼠AVL总黄酮提取物低、高剂量预防组（40mg/kg、80mg/kg）（C、D组）：抑郁造模前1周灌胃给予相应剂量的药物，直至造模结束；抑郁大鼠AVL总黄酮提取物低、高剂量治疗组（40mg/kg、80mg/ kg）（E、F组）：于抑郁造模后1周灌胃给予相应剂量的药物，直至造模结束；抑郁大鼠氟西汀治疗组（20mg/kg）（G组）：抑郁造模后1周予灌胃给药，直至造模结束。

1.2.2 抑郁大鼠模型 参照Willner等[2]方法，以CUMS建立抑郁动物模型。B、C、D、E、F、G各组大鼠在4周内接受各种温和应激，包括：昼夜颠倒24h、电激（控制电压至45V，每隔50s刺激1次，每次刺激10s，共30次）、禁食24h、禁水24h、热刺激（45℃环境刺激10min）、倾斜30°过夜。每天只给予1种刺激因子，且每种刺激因子累计使用2～3次。为避免大鼠产生适应性反应，每种刺激因子随机给予，使大鼠不能事先预料何种刺激的发生。

1.2.3 大鼠旷场实验 在实验前剔除自发活动能力差异较大的大鼠，每组选取10只。应激开始前1d和应激结束后（即第4周）各进行1次旷场实验。室内隔音，将大鼠放入44cm×44cm×47cm旷场箱的中心，测定5min水平和垂直运动得分。大鼠总运动距离更能客观、直接地反应动物的兴奋程度[3]，因此以大鼠总运动距离作为水平活动得分，以两前肢离地直立的次数为垂直活动得分。

1.2.4 组织样品的处理 实验结束后断头处死，冰上取脑，取前额叶皮层及海马组织50mg，加入2倍重量的蒸馏水，在匀浆器中匀浆5min获得均一的组织匀浆液。取组织匀浆液100μl，分别加入含内标尼莫地平（40ng/ml）的乙腈溶液0.3ml，涡旋混合2min，离心13 000r/min，10min，取上清液置另一试管中，在减压离心浓缩仪中挥干溶剂，残渣加入100μl流动相复溶，离心13 000r/ min，10min，取上清液10μl进行分析，检测各组大鼠前额叶皮层及海马组织的去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）和5-羟色胺（5-HT）水平。

1.2.5 检测仪器及色谱条件 采用Agilent 1260+AB Sciex 4000+液质联用仪。色谱条件：色谱柱型号：ZORBAX Extend C18（2.1×100mm，3.5m，美国Agilent公司）；流动相：乙腈-水-甲酸（75∶25∶0.1，v/v/v）；流速：0.3ml/ min；色谱柱温：30℃；进样量：10μl。质谱条件：离子源为电喷雾电离源（Turbo Ionspray）；离子源喷射电压为5 500V；温度为550℃；离子源气体1（GAS1）压力为50psi；离子源气体2（GAS2）压力为50psi；气帘气体（CUR）压力为30psi；电离模式：电喷雾电离，ES+；去簇电压（DP）分别为33 eV（NA）、68 eV（DA）、67eV（5-HT）和72eV（内标尼莫地平）；碰撞电压（CE）分别为9eV（NA），13eV（DA），15eV（5-HT）和13eV（尼莫地平）；扫描方式为选择离子监测（MRM），用于定量分析的离子为m/z 169.8→151.7（NA），m/z 154.1→136.9（DA），m/z 177.0→159.8（5-HT），m/z 419.5→343.2（IS）扫描时间为200ms。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。

2 结果

2.1 各组大鼠应激前后旷场实验垂直运动次数及水平运动总路程的比较 与A组相比，B组大鼠在旷场实验中的垂直运动次数及水平运动总路程减少，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；AVL总黄酮提取物干预后，C、D、E、F各组垂直运动次数及水平运动总路程均高于B组，并且随着给药剂量增加，各自主活动增加更为明显，E组垂直运动次数差异无统计学意义（P＞0.05），其余差异均有统计学意义（均P＜0.05），尤以D组增加最为明显（P＜0.01）；G组与B组比较，垂直运动次数及水平运动总路程均增加，差异均有统计学意义（均P＜0.01），详见表1。

表1 各组大鼠应激前后矿场实验垂直运动次数及水平运动总路程的比较

2.2 各组大鼠脑组织内单胺类神经递质水平的结果 与A组相比，B组在大鼠海马及前额叶皮层DA、NE、5-HT水平均有下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与B组比较，D组大鼠海马组织5-HT水平增高，差异有统计学意义（P＜0.01），前额叶皮层DA、NE、5-HT水平增高，差异均有统计学意义（P＜0.05或0.01）；G组海马组织DA、5-HT水平均高于B组（均P＜0.01），前额叶皮层DA、NE、5-HT水平增高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），详见表2、3。

表2 各组大鼠海马组织单胺类递质水平的比较（ng/g）

表3 各组大鼠前额皮层单胺类递质水平的比较（ng/g）

3 讨论

现代医学关于抑郁症的发病机制假说尚无定论，目前存在多种假说，而单胺假说是迄今为止研究最多、也是研究最深入的。该假说认为抑郁症的生物学基础是神经细胞突触间隙的单胺类神经递质5-HT、NE、DA的减少与缺乏，经抗抑郁药物治疗后，可以升高大鼠脑内该类物质水平从而达到治疗抑郁症的目的[4]。因此对抑郁动物脑内单胺类神经递质的测定，成为了筛选抗抑郁药物的重要指标。郑梅竹等[5]研究表明，AVL总黄酮提取物有与氟西汀相似的抗抑郁作用，AVL总黄酮提取物能使抑郁大鼠海马组织DA和NE水平明显上升，而5-HT水平无明显变化；同时给予AVL总黄酮提取物与DA受体（D1、D2受体）阻滞剂或NE受体（α1、α2、αβ受体）阻断剂后能产生抑郁样行为，明显延长悬尾小鼠累计不动时间，由此提出AVL总黄酮提取物抗抑郁作用与DA及NE受体系统有关[6-7]。

Papakostas等[8]曾行荟萃分析研究表明选择性5-羟色胺去甲肾上腺素再摄取抑制剂（SNRIs）对抑郁症的治疗反应优于选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs）。而目前亦认为具有多种药效活性的抗抑郁药物会产生更广谱的疗效。氟西汀是一种SSRI，但与其它SSRIs不同，能有效缓解“正性情感降低”症状，如丧失愉快感、丧失兴趣、精力不足、过度睡眠、注意力不集中等，这种激活作用，可能与其5-HT2C拮抗作用有关，可致NE和DA释放脱抑制，前额叶皮层NE和DA释放增加[9]。本研究显示，AVL总黄酮提取物有抗抑郁作用，尤其高剂量预防给药，其抗抑郁效应与氟西汀相似。此外，本研究结果显示，AVL总黄酮提取物除了增高海马组织的5-HT水平，还能升高前额叶皮层的DA、NE、5-HT水平，推测其与氟西汀相似的激活作用，作为三重神经递质作用的抗抑郁药物能全面改善抑郁症状。研究结果与郑梅竹报道中的差异，可能与样本量及脑组织部位是否精确选取有关。

综上所述，AVL总黄酮提取物具有抗抑郁作用，能全面改善抑郁症状，可用于抑郁症的二级预防，降低发病或复发风险。

[1]Xie WY,Zhang XY,Wang T,et al.Botany,traditionaluses,phytochemistry and pharmacology of Apocynum venetum L.(Luobuma):Areview[J].J Ethnopharmacology,2012,141(5):1-8.

[2]Willner P,Towell A,Sampson D,et al.Reduction of sucrose preference by chronic mild unpredictable stress and its restoration by a tricyelic antidepressant[J].Psychopharmacology,1987,93:358-364.

[3]林晓春,李云鹏,卞艳芳,等.大鼠旷场实验指标检测及参考值的探讨[J].毒理学,2010,24(3):224-225.

[4]Cryan J F,O'Leary O F,Jin S H,et al.Norepinephrine-deficient mice lack responses to antidepressant drugs,including selective serotonin reuptake inhibitors[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004, 101(21):8186-8191.

[5]郑梅竹,时东方,刘春明,等.罗布麻叶总黄酮提取物对抑郁大鼠脑内单胺类神经递质含量的影响[J].安徽农业科学,2011,39(26):15995－15997.

[6]Zheng M Z,Fan Y J,Shi D F,et al.Antidepressant-like effect of flavonoids extracted from Apocynum venetum leaves on brain monoamine levels and dopaminergic system[J].J Ethnopharmacology,2013,147(5):108-113.

[7]郑梅竹,时东方,范亚军,等.罗布麻叶总黄酮抗抑郁作用参与NE能系统可能机制的研究[J].广东农业科学,2012,16:169-171.

[8]Papakostas G I,Thase M E,Fava M,et al.Are antidepressant drugs that combine serotonergic and noradrenergic mechanisms of action more effective than the selective serotonin reuptake inhibitors in treating major depressive disorder?A meta-analysis of studies of newer agents[J].Biol Psychiatry,2007,62(11):1217-1227.

[9]StahlS M.Stahl精神药理学精要:神经科学基础与临床应用[M].司天梅译.3版.北京:北京大学医学出版社,2011:458-471.

Antidepressant effect of flavonoids extracted from Apocynum venetum leaves in rat model of depression

WANG Jia,XIE Jian,CHEN Yueming,et al.Department of Clinical Psychology,Hangzhou First People's Hospital，Hangzhou 310006,China

Objective To study the antidepressant effect and underlying mechanism of flavonoids extracted from Apocynum venetum leaves(AVL-extracts)in rat depression model． Methods The rat depression model was induced by the method of chronic unpredictable mild stress(CUMS).The open field test was used to evaluate the antidepressant effect of AVL-extracts.The rats were randomly divided into seven groups:control group,depression model group,low dose AVL-extracts prevention group (40mg/kg),high dose AVL-extract prevention group (80mg/kg),low dose AVL-extract treatment group (40mg/kg),high dose AVL-extract treatment group(80mg/kg)and fluoxetine treatment group.LC-MS/MS method was used to assay the levels of monoamine neurotransmitters,including norepinephrine (NE)，serotonin (5-HT)and dopamine (DA)in the hippocampus and the prefrontal cortex of rats. Results The open filed activities decreased significantly in the depression model group including horizontal movements and vertical movements with comparison to the normal group (P＜0.01).The autonomic activitiesincreased significantly after preventive administration of high dose AVL-extracts (P＜0.01).The antidepressant effect of AVL-extracts was similar to that of fluoxetine in increasing the autonomic activities.The levels of NE，DA and 5-HT in the brain of depressive rats were significantly lower than those in control group，whereas the levels of those in AVL-extract administration groups were higher than those in depressive group(P＜0.05).The effect was more significant in the high dose AVL-extract prevention group,and in which the level of 5-HT in the hippocampus and the levels of DA,NE and 5-HT in the prefrontal cortex were significantly increased(P＜0.01,P＜0.05,respectively)．These changes were also observed in fluoxetine administration group. Conclusion The study suggests that AVL-extracts have antidepressant effects on rat depres-sion model,which is associated with the reverse of monoamine neurotransmitters levels in rat brain tissue.

Apocynum venetum Depression Monoamine neurotransmitters

2015-07-01）

（本文编辑：严玮雯）

浙江省科技计划项目（2012c33005）；浙江省中医药科技计划项目（2012ZQ020）

310006 杭州市第一人民医院心理科（王佳、谢健、高力舒、张海生），检验科（陈岳明）

谢健，E-mail：srxjian@163.com