猪脾转移因子的制备和生物学活性研究

杜联峰，夏嫱，余妍，杨瑞，郭锦锦，孙万邦，朱进军

(遵义医学院珠海校区·贵州省免疫学研究生教育创新基地，广东 珠海 519041)



猪脾转移因子的制备和生物学活性研究

杜联峰，夏嫱，余妍，杨瑞，郭锦锦，孙万邦，朱进军

(遵义医学院珠海校区·贵州省免疫学研究生教育创新基地，广东 珠海 519041)

目的：采用冻融-透析法制备猪脾转移因子，并对其理化性质以及免疫学生物学活性、生物安全性进行初步检定。方法：采用低温匀浆反复冻融新鲜的猪脾脏、无菌离心匀浆脾脏组织液，取上清液透析制备转移因子；以改良Lowry法分别检测多肽含量，并进行理化指标、无菌试验、热原质试验及其生物学活性检测。结果：冻融-透析法制备猪脾转移因子的理化性状符合《中国生物制品》的要求；无菌试验、热原质试验均为阴性；安全试验合格；淋巴细胞转化试验和E花环形成试验证实其具有刺激淋巴细胞增殖生物学活性。结论：成功制备了猪脾脏转移因子，其各项理化指标符合生物制品规程的要求，同时具有较好的非特异性免疫学的生物学活性。

转移因子；非特异性免疫学生物学活性；理化性质

转移因子(transfer factor，TF)是从具有免疫活性的淋巴细胞中所释放出的一种具有生物学活性的物质，免疫活性淋巴细胞在抗原刺激下释放的TF能使未致敏的淋巴细胞转化为具有免疫活性的淋巴细胞，又能增强巨噬细胞的功能，以利于杀灭细胞内感染的病原微生物(各种病毒、细菌、霉菌及寄生虫等)，增强机体的免疫功能。TF主要成分是活性多肽，具有分子量小、无种属特异性、无免疫原性、不易引起超敏反应等诸多优点[1]。并且在临床治疗先天或后天免疫缺陷病、各种病毒感染性疾病等方面的取得了较好的疗效，因此TF在临床上应用有一定的应用前景[2-3]。近年来，随着各种新发传染病如：SARS、H7N9等病毒性传染病以及过敏性疾病在临床上出现越来越多，转移因子作为一种免疫调节剂受到国内外学者的广泛关注[4]。本研究采用冻融-透析法制备TF，并研究其理化性质和体外的非特异免疫学生物学功能，为猪脾转移因子的生产和应用上提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与器材

昆明小鼠，20 g左右，10只，遵义医学院珠海校区实验动物中心提供；健康家兔，3～4 kg左右，6只，遵义医学院珠海校区实验动物中心提供；新鲜猪脾脏，细胞计数板，显微镜，ELx-800型酶标仪。

1.2 实验试剂

EZ-SepTMMouse小鼠脾淋巴细胞分离液购自达科为生物技术有限公司，Cell Counting Kit-8( CCK-8)试剂购自日本同仁化学公司，RPMIl64O 培养液购自Gibico公司，胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)购自Hyclone公司。其余试剂为国产分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 透析法制备猪脾转移因子 将新鲜猪脾放于洁净方盘中，去除其筋膜、脂肪，然后用无菌三蒸水冲洗3次，剪成细小的碎块，称量后放入电动高速组织捣碎机中，按1:1比例加入无菌三蒸水，高速匀浆2 min。匀浆后的浆体用洁净的方盘盛装，放入-20 ℃低温冰箱中冷冻，在于37 ℃水浴中融化，反复冻融3次 ，3 000 r/min离心10 min，将上清液装入透析袋，放入按1∶1比例加入无菌三蒸水，于4 ℃透析，每12 h换液，换液两次，收集透析液，过滤除菌，分装，-20 ℃保存备用。

1.3.2 理化性状的检定 采用肉眼观察猪脾转移因子的颜色及其表观性状；测量pH值；紫外分光光度计进行多波长扫描，计算260 nm/280 nm OD值比值；改良Lowry法检测多肽的含量。并参照《中国生物制品规程》[9]进行无菌试验、热原质试验和安全试验。

1.3.3 猪脾转移因子生物学活性检测 (1)淋巴细胞转化试验：采用密度梯度离心法分离提取小鼠脾淋巴细胞，断颈处死小鼠，浸泡于75%的酒精中，在超净台内无菌取出小鼠脾脏，在培养皿中放入8 mL EZ-SepTMMouse 1×淋巴细胞分离液，用玻璃注射器芯将脾脏在400目金属网上轻轻地研磨，取细胞悬液立即转移到15 mL离心管中，轻轻加入500 μL的RPMI 1640培养基液覆盖(保持液面分界明显)。室温，800 g离心30 min，离心结束后细胞分层。吸取淋巴细胞层加入到另1只15 mL离心管中，再加入10 mL 1640培养基，颠倒洗涤。室温，250 g离心10 min收集细胞，倾倒上清液，再用无菌Hank’s液轻轻吹打混匀洗涤细胞两遍后，用含10%FBS 的RPMI 1640培养基重悬细胞，台盼蓝染色细胞计数，活细胞数大于97%以上，调整细胞数量至1×105个/mL，细胞悬液铺96孔板，每孔100 μL。细胞置37 ℃，5%CO2培养箱中培养。实验设实验组、阴性对照组及阳性对照组，每组设4个复孔，实验组加入猪脾转移因子使其终浓度为：实验分为实验组(分为4个浓度梯度)、PHA阳性对照组、阴性对照组。每组设4个复孔，实验组根据测量的转移因子原液多肽含量进行稀释，每孔加入5 μL，终浓度为1 mg/mL、500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL，阳性对照组加入PHA使其终浓度为5 μg/mL。细胞置37 ℃，5%CO2培养箱中培养72 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，继续孵育3 h后，酶标仪450 nm测量A值。(2)E玫瑰花环形成试验检测转移因子生物活性：无菌抽取3 mL EDTA抗凝人静脉血，加入等量Hank’s液混匀后，用毛细吸管将其转移至3 mL人淋巴细胞分离液上，1 500 r/min，离心15 min，离心后，吸取淋巴细胞放入另一15 mL离心管中，加适量Hank’s液洗涤，轻轻吹打混匀，1 500 r/min，离心5 min，弃去上清液，洗涤3次后，在沉淀物中加入适量RPMI 1640液，混匀，分成两份，一份在45 ℃恒温水浴保温30 min(每隔5 min振摇1次)，以1 500 r/min离心3～5 min，弃去上清液，再加入适量RPMI 1640液，混匀后，置45 ℃恒温水浴保温30 min，取出后以每分钟1 500 r/min离心5 min，弃上清液。用Hank’s液洗涤3次，再用Hank’s液适当稀释并计数，使最终浓度为每1 mL中5×106个细胞，为脱E受体外周血单个核细胞悬液。另一份用RPMI 1640液调节使其终浓度为5×106/mL，为未脱E受体外周血单个核细胞悬液。同时取适量绵羊血，用Hank’s液洗涤绵羊红细胞3次。加适量Hank’s液稀释并计数，使最终浓度为脱E受体外周血单个核细胞浓度的10倍(5×107/mL)。实验设实验组、阴性对照组及阳性对照组，实验组分为4个浓度梯度，分别为1 mg/mL、500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL。取6支小试管，1支阳性对照管中加未脱E受体T细胞悬液0.2 mL；1支阴性对照管中加脱E受体胸腺T细胞悬液0.2 mL；4支各加不同浓度转移因子溶液0.1 mL作测定管，测定管中各加脱E受体胸腺T细胞悬液0.2 mL；37 ℃保温1 h后，加入绵羊红血球悬液0.2 mL，摇匀，以500 r/min离心3 min，放入4 ℃冰箱过夜，次日取出，弃上清液，每管中各加入0.8%戊二醛固定液0.1 mL，轻轻摇匀，静置10 min，加入吉姆萨染色液2滴并摇匀，静置15 min后开始计数，统计实验各组的E玫瑰花环结合的细胞数求得E玫瑰花结合百分率。

1.4 统计学分析

将所得数据以平均值±标准差表示，用方差分析软件SPSS 19.0中的One-way ANOVA进行方差分析。

2 结果

2.1 理化指标的检测

转移因子的理化指标均符合2008版《中国生物制品规程》的要求(表1)。

表1 猪脾转移因子的理化性状结果

2.2 猪脾转移因子生物学活性检测

2.2.1 淋巴细胞增殖试验结果 淋巴细胞在培养72 h后加入CCK-8试剂继续培养3 h后检测，结果显示阳性对照(PHA)组与阴性对照组相比可以明显促进小鼠脾细胞的增殖(P<0.05)，各实验组与阴性对照组可以明显促进小鼠脾细胞的增殖(P<0.05)，其中 500 μg/mL和250 μg/mL组浓度的A值较高，与阴性对照组相比差异有显著性差异(P<0.05)，说明我们制备的TF在500 μg/mL或250 μg/mL可以明显促进小鼠脾细胞的增殖。与阳性对照(PHA)组相比无显著差异(P>0.05)，而1 mg/mL和125 μg/mL组的淋巴细胞增殖试验结果和阴性对照组比较无显著性差异(P>0.05)(表2)。

表2 不同浓度转移因子对小鼠脾淋巴细胞增殖的作用

*P<0.05，与阴性对照组比较。

2.2.2 E玫瑰花环形成试验结果 各实验组与阴性对照组E花环形成率均有化明显增加，与阴性对照组比较有显著性差异(P<0.05)，其中500 μg/mL和250 μg/mL组，E花环形成率较高，分别为37.7%和39.1%，较阴性对照增加了17%以上。而1 mg/mL和125 μg/mL组的E花环形成率分别为27%和24.5%，低于500 μg/mL和250 μg/mL组，说明TF对T细胞的刺激作用没有明显的量效关系。

*P<0.05，与阴性对照组比较。

3 讨论

TF的制备方法有很多种，主要有透析法、超滤法等[5-6]。透析法是制备TF常用的标准方法，它不需离心和专业的超滤设备，是一种适合实验室生产TF的常用方法。超滤法是一项在压力驱动下的膜过滤技术，是近年来随着对生物膜机制的深入研究和认识发展起来的一种新技术，现在超滤法已经逐渐成为适于转移因子的工业化大规模生产的主要方法。超滤法相对透析法来说需要专业的超滤设备，而且在超滤前需要通过离心和蛋白质沉淀技术去除大分子蛋白和杂质，生产步骤相对繁琐，但它产率高，适合工业化生产[10]。本实验通过冻融-透析法成功地制备了猪脾TF，新鲜猪脾经高速匀浆后，放入-20 ℃低温冰箱中冻存，再进行融化，经透析、过滤除菌即可以制得猪脾TF，此法既简单又经济，适合实验室小量生产和研究[7-8]。在制备过程中发现，提高TF多肽含量的关键步骤是在于脾脏匀浆的冻融的次数，对TF的收率和质量有很大的影响，在冻融过程中破坏细胞，使细胞内的小分子多肽和多核甘酸完全释放出来，冻融次数多可以提高TF多肽的含量，但是冻融次数越多，其产品中核糖和多肽的比值就越低，而且容易受到细菌的污染。同时因为TF在高温下容易失去活性，所以相应的操作步骤应在低温下进行，如匀浆、透析的操作过程都应在4℃条件下进行。

本实验还通过淋巴细胞转化试验检和E花环实验检测制备的TF非特异性免疫学生物学活性，实验证实制备的TF在500 μg/mL和250 μg/mL浓度下具有较好的刺激小鼠淋巴细胞转化增殖的能力和较高E花环形成率。说明我们制备的猪脾TF在500 μg/mL和250 μg/mL浓度下能够有效的增强机体非特异性免疫能力。我们所采用冻融-透析法制备猪脾TF的方法是一种有效、可行的实验方法。目前随着人口的老龄化，和后天性免疫缺陷病(如AIDS)的增加，在临床上出现越来越多病毒性传染病以及过敏性疾病，转移因子作为一种免疫调节剂，在临床上有广泛的应用前景，并且取得了较好的效果[11-13]。

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(学术编辑：杨健)

本刊网址：http：//www.nsmc.edu.cn

作者投稿系统：http：//noth.cbpt.cnki.net

邮箱：xuebao@nsmc.edu.cn

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Preparation and biological activity research of porcine spleen transfer factor

DU Lian-feng，XIA Qiang，YU Yan，YANG Rui，GUO Jin-jin,SUN Wan-bang，ZHU Jin-jun

(ZunyiMedicalCollegeZhuhaiCampus，GraduateEducationandInnovationBaseofImmunologyinGuizhouProvince,Zhuhai519041,Guangdong,China)

Objective：Preparing pig spleen transfer factor by freeze thaw dialysis method,to preliminarily study the physicochemical properties,the biological activity of immunology and biological safety.Methods：Freezing and thawing fresh pig spleen by cryogenic homogenization repeatedly,getting supernatant dialysis from aseptic centrifugal homogenate of spleen tissue fluid to prepare the transfer factor.The content of polypeptide was detected respectively by modified Lowry polypeptide content;the physicochemical indexes,sterility test,pyrogen test and biological activity were detected too.Results：The physicochemical properties of pig spleen transfer factor by freeze thaw dialysis method consists with “China Biological Products” requirement;sterility test and pyrogen test are negative;safety tests is qualified;lymphocyte transformation test and E rosette formation test confirms that it has to stimulate lymphocyte proliferation biological activity.Conclusion：Successfully preparing pig spleen transfer factor,its physicochemical indexes are in line with the requirements for Biological Products,and have good biological activity of nonspecific immunology.

Transfer factor;Non-specific immunological biological activity;Physicochemical properties

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.02.10

贵州省教育厅自然科学项目(20090105)

2015-09-04

杜联峰(1976-)，男，硕士，副教授。E-mail：8wy149842@163.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160425.1131.020.html

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