组培技术提高白背三七试管苗中总黄酮含量

高 媛, 刘宇峰, 宋淑敏, 姬妍茹, 杨庆丽, 张正海

黑龙江省科学院大庆分院, 黑龙江 大庆 163319



组培技术提高白背三七试管苗中总黄酮含量

高 媛, 刘宇峰*, 宋淑敏, 姬妍茹, 杨庆丽, 张正海

黑龙江省科学院大庆分院, 黑龙江 大庆 163319

为了建立一种提高白背三七试管苗总黄酮含量的组织培养技术，采用组织培养技术，改变激素配比、碳源、微量元素(Mn2+：Zn2+)比例和氮源，来提高白背三七试管苗中总黄酮的含量。正交实验结果表明，当碳源为蔗糖30 g/L、微量元素Mn2+：Zn2+比为44.6 mg/L：13.2 mg/L、氮源KNO3：NH4NO3为2 020 mg/L：1 600 mg/L、激素比NAA：6-BA为0.1 mg/L：1.5 mg/L时，白背三七试管苗中总黄酮含量相对于原盆栽植株提高了15%。通过组织培养技术建立了一种可提高白背三七总黄酮含量的繁殖体系，为白背三七优良种苗的培育提供技术支持，该研究结果也表明利用组织培养技术改变培养基中物质配比有益于植物生长和次生代谢产物积累。

白背三七；组织培养；总黄酮含量提高；试管苗

白背三七(Gynuradivaricata(L.)DC)，多年生草本，是传统中草药的一种，分布广泛，是一种食用和药用兼有的优良品种，主要在中国南部、西南部和台湾[1]。植物组织培养技术是利用细胞的全能性，在无菌条件下将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体在人工培养基上培养，在人工控制的环境中生长、分化、繁殖成为新的植株的过程和技术[2]。组培技术已广泛的应用于育种和快速繁殖、脱毒、种质保存以及植物次生代谢产物生产等方面。利用植物组织细胞培养技术来对白背三七进行育种已有报道[2～5]，其叶片、叶柄和茎段处均能直接分化出丛生芽，提高了其繁殖的速度。

白背三七具有药用和保健功能是因其含有丰富的总黄酮类等[6]。黄酮类属于植物次生代谢产物，是多种中药发挥生理作用的物质基础。组织培养已成为生产植物次生代谢药用成分的重要手段[7]。改变培养基种类及激素配方能够获得适合于植物次生代谢产物的悬浮细胞培养体系[8]。李琰等[9]改变培养基及培养条件提高了杜仲愈伤组织中次生代谢产物总黄酮的含量。改变了培养条件也能够改变甘草愈伤组织次生代谢产物的多样性[10]。植物激素是组培中影响次生代谢产物含量的重要因素。不同浓度配比的激素组合将直接影响愈伤组织的生长和其次生代谢产物的合成[11]。微量元素是植物生长中所必须的，能够参与植物体内的代谢，也是很多酶的活化剂，因此能影响植物的代谢和次生代谢产物的合成和积累[12]。已有的研究表明，培养基中的微量元素对雷公藤总生物碱及雷公藤甲素的含量影响显著[13]。

而目前对于白背三七组织培养的研究中，已经建立了成本低廉、周期短的快速繁殖体系[1,3,4]。对于如何利用组织培养技术提高白背三七试管苗茎叶总黄酮含量的研究尚无报道。本研究以白背三七的幼嫩茎叶为材料诱导得到试管苗，探讨在培养基中不同激素配比、不同氮源、不同碳源和微量元素比例对白背三七试管苗中总黄酮积累的影响，明确了植物激素、氮源、碳源和微量元素比例对白背三七试管中总黄酮合成的影响，为提高白背三七的总黄酮含量提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料及材料处理

野生型的白背三七采自南京市郊区，采集时间为2015年10月，采集白背三七地上部分，对取得的植株在通风处干燥，真空包装后带回进行测定，经黑龙江省科学院大庆分院刘宇峰研究员鉴定为白背三七(Gynuradivaricata(L.) DC.)。大棚盆栽苗为南京郊区引种的白背三七，与组培所用白背三七为同一批。

已有研究表明，在三七组织中茎叶中总黄酮含量最高[14]，在10月份时白背三七的总黄酮含量为最高[15]，因此本研究中使用10月份的白背三七顶端幼嫩茎叶进行组织培养得到愈伤组织。按照无菌操作规程在超净工作台上完成，采集白背三七的顶端幼嫩茎叶，冲洗干净，用次氯酸钠溶液(20g/L)消毒10 min，以无菌水冲洗干净。接种于高温高压灭菌的MS培养基中培养，将外植体接种到MS诱导培养基中诱导分化愈伤组织，得到的愈伤组织进行试管苗诱导。在培养45～50 d后，将获得的试管苗取下，将培养基清洗干净并去除愈伤组织后进行总黄酮含量的测定。

1.2 培养基及培养条件

本实验采用MS培养基。诱导培养基为MS培养基中添加30 g/L蔗糖，琼脂含量为7%，pH 5.5～6。NAA浓度为0.5 mg/L，6-BA浓度为2.0 mg/L，诱导得到愈伤组织，对初次得到的愈伤组织进行继代培养以得到状态较一致的愈伤组织，为后续的实验做好准备。愈伤组织诱导分化得到试管苗的实验中，也采用MS培养基，琼脂含量为7%，pH 5.5～6，根据实验设计改变其中的激素比例和微量元素(Mn2+和Zn2+)比例、碳源和氮源。培养条件为光照强度2 000 lx，培养温度为25±2℃，光照时间为16 h。

1.3 总黄酮含量测定

总黄酮含量的测定采用紫外分光光度法。将新鲜试管苗清洗干净后进行减压干燥、研磨，取适量样品进行总黄酮的提取，以芦丁作为标准品，在510 nm处测定，计算得到试管苗中总黄酮含量[16]。

1.4 不同激素比例对试管苗总黄酮含量的影响

在基本MS培养中加入生长素NAA和细胞分裂素6-BA，其具体比例如表1所示。NAA浓度设定为0 mg/L、0.1 mg/L和0.2 mg/L，6-BA设定为0.5 mg/L、1 mg/L和1.5 mg/L。将继代培养得到的愈伤组织接种到改变激素配比的培养基中，诱导分化得到试管苗，测定试管苗中总黄酮的含量。

表1 激素比例设定Table 1 The settings of hormone ratio.

1.5 不同微量元素(Mn2+和Zn2+)对试管苗总黄酮含量的影响

不同Mn2+和Zn2+比例实验采用硫酸锰(MnSO4)和硫酸锌(ZnSO4)在MS基本培养基中调整Mn2+和Zn2+两种离子的浓度，具体设定如表2，MnSO4设定为0 mg/L、11.15 mg/L、22.3 mg/L、44.6 mg/L、89.2 mg/L，ZnSO4设定为0 mg/L、3.3 mg/L、6.6 mg/L、13.2 mg/L、26.4 mg/L。测定培养试管苗中总黄酮的含量。

表2 微量元素Mn2+和Zn2+的设定Table 2 The settings of the dosage of trace elements Mn2+ and Zn2+.

1.6 不同碳源对试管苗总黄酮含量的影响

在MS基本培养基中加入淀粉、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖和果糖作为碳源，浓度为30 g/L，将愈伤组织接种培养基上诱导分化产生试管苗，观察试管苗的生长情况并测定试管苗中总黄酮的含量。

1.7 不同氮源对试管苗总黄酮含量的影响

表3 氮源设定Table 3 The settings of the dosage of Nitrogen source.

1.8 正交试验

选择激素比、微量元素比、氮源、碳源每个因素总黄酮含量最高的3个水平做4因素3水平实验，得出最优水平测定总黄酮得率。

2 结果与分析

2.1 不同激素配比对试管苗总黄酮含量的影响

在不同的激素配比下诱导得到试管苗，因激素配比的不同，所得到的试管苗总黄酮含量也不同(图1所示)。在H3(NAA：6-BA为0.1 mg/L：1.5 mg/L)的激素水平下，得到了总黄酮含量最高的试管苗(3.5±0.11 mg/g)，H2(3.4±0.2 mg/g)次之。而在H1和H4情况下，总黄酮含量最低为零，愈伤组织未能分化成为试管苗，其他的激素配比下虽能检测得到试管苗中的总黄酮，但是总黄酮的含量也比较低。

图1 不同激素配比设定下得到试管苗中总黄酮含量Fig.1 The total flavonoids content of Gynura divaricata callus from different hormone ration.

2.2 不同Mn2+和Zn2+比例对试管苗总黄酮含量的影响

锰离子是必须的微量元素之一，是硝酸还原酶的活化剂。Mn2+和Zn2+属于重金属，会对植物的生命活动造成胁迫，从而干扰植物多种生物学进程，影响次生代谢[17]。由图2可知，在培养基中缺少了两种金属离子时(M8)，试管苗无法长成，因而总黄酮含量为零。而Mn2+和Zn2+单独存在时(M1和M2)，试管苗总黄酮含量较低，分别为(1.6±0.11) mg/g和(1.2±0.17)mg/g，当在M6(MnSO4：ZnSO4为44.6 mg/L：6.6 mg/L)条件下，最适合试管苗中总黄酮含量的积累，达到(3.2±0.36) mg/g。这也表明微量元素在白背三七的次生代谢过程中起着重要的作用。

图2 不同微量元素设定下白背三七试管苗中总黄酮含量Fig.2 The total flavonoids content of Gynura divaricata callus from different trace elements ration.

2.3 不同碳源对试管苗总黄酮含量的影响

碳源为植物生长提供了能源，因此碳源也对植物的生长起到很大的影响。如图3所示，在以蔗糖为碳源的培养基上得到的试管苗的总黄酮含量最高为(3.4±0.22)mg/g，完全高于另外的4种碳源。而以淀粉作为碳源的培养基上无法分化形成试管苗，愈伤组织经过一段时间后死亡，总黄酮含量最低为零。葡萄糖为碳源得到的分化苗很小，生长营养不良，总黄酮含量为(1.0±0.36)mg/g；另两种的碳源也不适合试管苗的分化及次生代谢产物的积累，麦芽糖和果糖为碳源的培养基上得到的试管苗总黄酮含量分别为(2.3±0.29)mg/g和(2.2±0.28)mg/g。

2.4 不同氮源对试管苗总黄酮含量的影响

氮源是关系植物生长发育必须的，也是限定性因素，本试验采用了硝态氮和铵态氮作为研究对象。如图4所示当氮源全部为铵态氮或硝态氮时，总黄酮的含量最低，分别为N1(1.4±0.25 mg/g)和N2(1.8±0.14 mg/g)。而当两种氮源并存时，其中总黄酮含量最高的是N5(3.1±0.22 mg/g)，即氮源为硝酸钾：硝酸铵为2 020 mg/L：1 600 mg/L。对N5和N6结果进行统计学分析，结果表明P<0.05，差异显著。

图3 不同碳源设定下总黄酮含量Fig.3 The total flavonoids content of Gynura divaricata callus from different carbon source ration.

图4 不同氮源设定下总黄酮含量Fig.4 The total flavonoids content of Gynura divaricata callus from different nitrogen source ration.

2.5 正交实验结果

由表4的极差分析结果可以看出，RC>RA>RD>RB，4个因素对总黄酮含量的影响大小依次为氮源(C)>激素配比(A)>碳源(D)>Mn2+：Zn2+(B)。4因素中，氮源的影响最为显著。在试验设计范围内，优化到的最优培养条件为C2A2D1B1，即碳源为蔗糖30 g/L、微量元素比Mn2+：Zn2+为44.6 mg/L：13.2 mg/L、氮源KNO3：NH4NO3为2 020 mg/L：1 600 mg/L、激素比NAA：6-BA为0.1 mg/L：1.5 mg/L。

表4 正交实验结果Table 4 The result of orthogonal experiment.

2.7 验证实验

按C2A2D1B1条件进行3次平行实验，总黄酮量平均值为3.8 mg/g，高于表4中每一项试验结果，故C2A2D1B1为最佳培养基条件。

3 讨论

植物次生代谢产物是植物通过次生代谢产生的一类细胞生命活动或生长发育正常运行的非必需化合物，合成受到环境等多种因素影响[18]。利用组织培养技术生产植物次生代谢物质具有不依赖和消耗自然植物资源的特点[19]。白背三七总黄酮属于次生代谢产物，如何提高试管苗的次生代谢产物的产量，改变培养基的组成是关键。植物体合成次生代谢产物受到两个方面的影响：外界条件和细胞内部因素的严格调控。以往的研究主要集中在愈伤组织中总黄酮含量的提高，而对于白背三七试管苗中总黄酮累积的影响因素鲜有报道。目前已经建立了白背三七悬浮细胞培养体系，优化了培养条件[20]。利用悬浮体系生产药用次生代谢产物具有在提高产率、缩短周期同时不受环境和气候影响等优点，但是也存在着稳定而高产的细胞系较难获得、污染和褐化的问题难以解决、并且成本高、代谢产物含量不稳定等诸多问题[21]。而改变培养基和培养条件能够提高甘草愈伤组织[10]、灵菊七愈伤组织[22]、银杏叶片愈伤组织[23]和青钱柳愈伤组织[8]中黄酮的含量。而愈伤组织进而诱导成植株或者培养成悬浮细胞系，直接用于提取有效成分的少。本研究利用组织培养技术对白背三七进行组织培养，研究改变培养基中的激素配比、微量元素的比例、碳源和氮源对试管苗中总黄酮含量的影响，以获得提高试管苗中总黄酮含量的最佳处置方法。本研究中试管苗可作为高总黄酮的种苗，为白背三七育种提供依据，虽然时间耗时长于悬浮培养体系，但是相对成本较低，且能够获得稳定产量。

外植体的选择对组培有很大的影响，对总黄酮的含量也有着很大的影响，因此本次研究中采用了报道中总黄酮含量高的白背三七的茎叶作为材料，取得了较好的效果。植物激素是组织培养中培养基的关键物质，NAA和6-BA是最常用的植物激素，诱导效果好。已有的研究表明，在很多植物的总黄酮合成过程中，植物激素的浓度和种类能够调控其生物合成过程[24]。本研究的结果表明总黄酮的生物合成受激素浓度的影响很大。而对于植物激素如何能具体调控黄酮生物合成路径需要进一步的研究。

碳源作为能源物质，参与了植物体内众多的代谢活动。而已有的研究表明，糖可在细胞内以信号分子存在，对许多过程中起到调控作用。在培养基中的糖除作为碳源外，还起到调节细胞内外渗透压的作用[25]。本研究中采用不同的糖类作为碳源，结果表明在本研究中蔗糖是最佳的碳源。氮源也是植物生长的必须因素。在本研究中硝态氮和铵态氮的混合使用对总黄酮的积累有提高作用，而单独使用这两种氮源则出现了试管苗生长不好，且总黄酮的含量也不高的现象。微量元素的不同对白背三七试管苗中总黄酮的积累有着不同程度的影响。Mn2+和Zn2+都是微量元素，其大量存在会危害植物的生长，在合适的范围内会促进植物生长并提高植物体内的次生代谢产物。在缺乏时会导致试管苗无法正常生长，对本次实验中总黄酮的累积有很大的影响。在试管苗的生长过程中，各个因子都会对其产生影响，因此各个影响因子的协同作用对提高次生代谢产物是十分必要的。

利用组织培养技术在白背三七组织培养中改变植物激素配比、微量元素比例、碳源和氮源能够提高试管苗中总黄酮的含量，其最佳的组合是碳源为蔗糖 30 g/L、微量元素比Mn2+44.6 mg/L：Zn2+13.2 mg/L、氮源KNO32 020 mg/L：NH4NO31 600 mg/L、激素比NAA 0.1 mg/L：6-BA 1.5 mg/L，总黄酮含量达到3.8 mg/g，比其盆栽植株3.3 mg/g提高了15%。改变培养基中营养因子对植物生长和次生代谢产物积累有益，这也为植物提高物次生代谢产物提供了新的方法。

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The Improvement of Total Flavonoids Content ofGynuradivaricataCallus by the Tissue Culture Technology

GAO Yuan, LIU Yu-feng*, SONG Shu-min, JI Yan-ru, YANG Qing-li, ZHANG Zheng-hai

DaqingBranchofHeilongjiangAcademyofSciences,HeilongjiangDaqing163319,China

The test mainly aimed at the establishment of a tissue culture technology to improve the total flavonoids ofGynuradivaricatecallus. The tissue culture technology was used to change the MS medium with different hormone combination, carbon source, nitrogen source and trace element ratio. The orthogonal experiment results showed that the maximum total flavones content was increased by 15% when the NAA∶6-BA was 0.1 mg/L∶1.5 mg/L, carbon source was 30 g/L, Mn2+∶Zn2+was 44.6 mg/L∶13.2 mg/L and nitrogen source KNO3∶NH4NO3was 2 020 mg/L∶1 600 mg/L. A system of tissue culture was developed for the enhancing of the total flavonoid of theG.divaricataDC, which was helpful for the seeding cultivation technology ofG.divaricataDC and provided essential principles and techniques of improving the secondary metabolism for further research.

Gynuradivaricata(L.)DC; tissue culture technology; total flavonoids content; callus

2016-06-23; 接受日期：2016-08-16

黑龙江省科学院青年基金资助项目资助。

高媛，硕士研究生，研究方向为植物组织培养及应用微生物。E-mail: gao1984yuan@163.com。*通信作者：刘宇峰，研究员，研究方向为植物生物技术。E-mail:384751172@qq.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.06.13