超高压乳铁蛋白液增强免疫力功能研究

陈伟，陈云，刘宇，李志伟，史玉东，魏雪涛，母智深，*

（1.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司，内蒙古呼和浩特011500；2.北京大学公共卫生学院，北京001500）

超高压乳铁蛋白液增强免疫力功能研究

陈伟1，陈云1，刘宇1，李志伟1，史玉东1，魏雪涛2，母智深1，*

（1.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司，内蒙古呼和浩特011500；2.北京大学公共卫生学院，北京001500）

研究超高压乳铁蛋白液增强免疫力功能。将受试者按采用B1/FQ代加快雌性小鼠，设1.67、10、100mg/kg·bw 3个剂量组，另外设置0mg/kg·bw和10mg/kg·bw乳铁蛋白（未经超高压）对照组，连续给样1个月，检测小鼠体重、胸、脾脏器官、Con A诱导的脾淋巴细胞转化、SRBC诱导的DTH、溶血空斑数、血清半数溶血值（HC50）、碳廓清能力、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞、NK细胞活性的影响。100mg组在体液免疫、细胞免疫功能、促进巨噬细胞吞噬功能与对照组有显著性（P<0.05）均为阳性，可判断100mg剂量对小鼠有增强免疫功能。超高压乳铁蛋白液仍具有增强免疫力功能。

乳铁蛋白；超高压；动物试验；增强免疫力

乳铁蛋白（Lactoferrin，Lf）是1939年由Sorensen等在动物乳中发现的一种功能因子[1]。由于其有许多生理功能，引起了各个领域学者的关注。尤其是近年来，随着乳铁蛋白功能的不断阐明，其开发利用更具实用价值。研究表明，乳铁蛋白具有很多生理和生物学功能[2]，与免疫球蛋白和其他保护性因子相协调参与局部分泌免疫，减少损伤和损伤愈合作用[3-6]。乳铁蛋白是目前公认的具有多效免疫调节活性的蛋白质，其对机体的免疫调节作用将会越来越受到重视，它可以影响多种免疫细胞，包括淋巴细胞、巨噬细胞、朗罕氏细胞等[7]。有理由相信，乳铁蛋白将会成为未来免疫调节治疗的重要手段之一，但其调节机体免疫的机制仍需进一步深入探讨。然而乳铁蛋白在热的条件下特别容易失活以及降解。早在1977年,RUEGG等就研究了牛乳超滤透过液中的牛乳铁蛋白的热稳定性,在pH值为6.6、温度为65℃～69℃时开始失活。此后，人乳铁蛋白的热稳定性得到系统研究,结果表明对70℃加热处理已使它完全降解[8]。

超高压（UHP，ultrahigh pressure）是在室温或温和加热条件下，利用100MPa～1 000MPa的压力处理食品,以达到杀菌、钝酶和加工食品的目的[9]。当食品物料在液体介质中体积被压缩之后，形成高分子物质立体结构的氢键、离子键和疏水键等非共价键即发生变化，结果导致蛋白质、淀粉等发生变性，酶失去活性，细菌等微生物被杀死[10]。为了验证超高压条件下的乳铁蛋白液是否失活，以及超高压的乳铁蛋白是否具有增强免疫力的功能开展本实验。本试验对超高压进行了动物试验，依据《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）[11]有关规则评判对产品是否具有增强免疫力功能进行评价。为其在乳制品中应用打下理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

RPMI1640、Hanks液、SA缓冲液、补体、LDH基质液、MTT、荧光乳胶颗粒、Na2CO3等。

打孔器；BS2000S分析天平、BS200S-WE1电子天平：德国塞多利斯；UV2600分光光度计：日本岛津；流式细胞仪：美国BD；Celculture二氧化碳培养箱、超净工作台：新加坡Esco；Elx808酶标仪：美国biotek；HPP HPP600MPa/30 L超高压食品处理设备：包头科发。

1.2 样品制备

超高压乳铁蛋白液的制备：将搅拌均匀的乳铁蛋白（新西兰Tatua）的质量分数为10%灌装于铝箔袋中，经600MPa 30min压力处理后备用。

对比组：同一批次的乳铁蛋白。

1.3 动物及分组

选用ICR小鼠（SPF级）由北京大学医学部实验动物科学部提供（动物合格证号：SCXK（京）2011-0012），6周龄～8周龄，19 g～25 g，雌性300只。动物饲料：由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。饲料合格证号：SCXK（京）2014-0010。按体质量随机组，每组12只，各取5组分别进行；SRBC诱导小鼠迟发型变态反应（DTH）、小鼠碳廓清实验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验、小鼠抗体生成细胞及半数溶血值（HC50）实验、ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化及NK细胞活性实验等5个实验项目[11]。

1.4 饲养条件

小鼠在温度为20℃～25℃，相对湿度为40%～70%的实验室屏障系统中饲养。动物饲养于屏障环境中，实验动物使用许可证号：SYXK（京）2012-0011。

1.5 剂量

乳铁蛋白（乳铁蛋白牛奶4mg/100 g）的人体推荐剂量500mL/（人·日），折算成原料粉的人体推荐剂量为20mg/（人·日）（以60 kg体质量计），设1.67、10、 100mg/kg 3个剂量组（分别相当于人体推荐摄入量的5倍、30倍、300倍），另设0mg/kg组以及10mg/kg非超高压对照组，经口每日1次给予小鼠相应质量浓度的受试样品，小鼠灌胃量为10mL/kg。连续灌胃1个月后测定各项增强免疫力功能指标[11]。

1.6 方法

ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化实验（MTT法）；SRBC诱导小鼠迟发型变态反应（DTH）（足跖增厚法）；抗体生成细胞检测（Jeren改良拨片法）；血清溶血素测定（半数溶血值）；小鼠碳廓清实验；小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验（半体内法）；NK细胞活性测定（乳酸脱氢酶测定法）[11]。

1.7 数据分析

用SPSS10.0软件对各实验原始数据进行方差齐性检验，满足方差齐要求的数据资料，用单因素方差分析方法中多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理；对非正态分布或方差不齐的数据资料进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换所得的数据进行统计处理[11]。

2 结果与分析

2.1 超高压乳铁蛋白对小鼠体重的影响

表1为乳铁蛋白对小鼠体质量的影响。

表1 乳铁蛋白对小鼠体重的影响Table1 Theeffectof lactoferrin on weightofm ice

由表1可以看出，小鼠的初始体质量为1.67、10、100mg/kg组与0 g/kg组比较，差异无统计学意义。表明小鼠的初始体质量在各组间较为均衡。经口给予小鼠不同剂量组的乳铁蛋白1个月后，各剂量组体重增长值经方差齐性检验，满足方差齐性要求，用单因素方差分析方法中多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。0.08、0.17、0.50 g/kg组与0 g/kg组比较，差异无统计学意义。

2.2 对小鼠胸腺、脾脏器官的影响

经口给予小鼠不同剂量组的乳铁蛋白液（超高压）1个月后，胸腺/体质量、脾/体质量经方法齐性检验，满足方差齐性要求，用单因素方差分析方法中多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理，结果如表2所示。

由表2可以看出：1.67、10、100mg/kg组与0 g/kg组及10mg/kg乳铁蛋白液比较，差异无统计学意义。

表2 乳铁蛋白液（超高压）对小鼠免疫器官重量的影响（x±s）Table2 Theeffectof lactoferrin（UHP）on theweightof immune organsofm ice（x±s）

2.3 对溶血空斑数的影响

经口给予小鼠不同剂量组的乳铁蛋白液（超高压）1个月后，结果如表3所示。

表3 乳铁蛋白液（超高压）对小鼠IgM-PFC/脾的影响（x±s）Table3 Theeffectof lactoferrin（UHP）onm icespleen IgM-PFC（x±s）

由表3可以看出，100mg/kg对小鼠IgM-PFC/脾显著高于其它组。10mg/kg乳铁蛋白液（超高压）对小鼠IgM-PFC/脾显著高于对照组，而10mg/kg乳铁蛋白液对小鼠IgM-PFC/脾与对照组无差异。

2.4 对小鼠血清溶血素的影响

经口给予小鼠不同剂量组的乳铁蛋白液（超高压）1个月后，结果如表4所示。

表4 乳铁蛋白液（超高压）对小鼠血清溶血素的影响（x±s）Table4 Theeffectof lactoferrin on Serum hemolysin inmouse（x±s）

由表4可以看出，各剂量组与10mg/kg乳铁蛋白液（超高压）组与对照组相比相比对小鼠血清溶血素的影响有着现在差异，而10mg/kg乳铁蛋白液对照组以及100mg/kg乳铁蛋白液（超高压）组与对照组相比存在极显著差异（P＜0.01）。实验发现10mg/kg超高压乳铁蛋白液与蛋白对照组比较，存在显著差异。

2.5 对DNFB诱导的小鼠DTH的影响

经口给予小鼠不同剂量组的乳铁蛋白液（超高压）1个月后，结果如表5所示。

表5 乳铁蛋白液（超高压）对小鼠DTH的影响（x±s）Table5 Theeffectof lactoferrin on DTH inm ouse（x±s）

由表5可以看出，100mg/kg组足跖增重显著高于0 g/kg组。同时发现同剂量（10mg/kg）的超高压乳铁蛋白液较未超高压的足跖增加厚度要大，但无统计学差异。

2.6 对ConA刺激的小鼠脾淋巴细胞转化功能的影响

经口给予小鼠不同剂量组的乳铁蛋白液（超高压）1个月后，结果如表6所示。

由表6可以看出，100mg/kg组对ConA刺激的小鼠脾淋巴细胞转化功能显著高于0 g/kg对照组。

2.7 对小鼠碳廓清能力的影响

经口给予小鼠不同剂量组的乳铁蛋白液（超高压）1个月后，结果如表7所示。

由表7可以看出：1.67mg/kg～100mg/kg的乳铁蛋白液（超高压）和10mg/kg乳铁蛋白液（未处理）均具有升高小鼠廓清指数的能力，表现为对吞噬功能的促进效应。与溶剂对照相比，差异具有统计学意义。10mg/kg高压与未高压剂量组均有极显著差异，高压与未高压乳铁蛋白对小鼠碳廓清能力的影响无差异。

表6 乳铁蛋白液（超高压）对ConA刺激的小鼠脾淋巴细胞转化功能的影响（x±s）Table6 Theeffectof lactoferrin（UHP）on ConA-induced spleen lymphocyte proliferation ability ofmouse（x±s）

表7 乳铁蛋白液（超高压）对小鼠碳粒廓清功能的影响（x±s）Table7 Theeffectof lactoferrin（UHP）on carbon clearance ability inm ouse（x±s）

2.8 对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光胶珠功能的影响

经口给予小鼠不同剂量组的乳铁蛋白液（超高压）1个月后，结果如表8所示。

表8 乳铁蛋白液（超高压）对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光胶珠功能的影响（x±s）Table8 Theeffectof lactoferrin（UHP）on the function of phagocytosisof fluorescentbeadsofmousem acrophages（x±s）

由表8可见，100mg/kg乳铁蛋白液（超高压）具有促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光胶珠的能力，无论是细胞吞噬率还是平均荧光强度均较溶剂对照组升高，差异具有统计学意义。

2.9 对小鼠NK细胞活性的影响

经口给予小鼠不同剂量组的乳铁蛋白液（超高压）1个月后，NK细胞活性经sin-1P1/2（P为NK细胞活性，用小数表示）转化后经方差齐性检验，满足方差齐性要求，用单因素方差分析方法中多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理，结果如表9所示。

表9 乳铁蛋白液（超高压）对小鼠NK细胞活性的影响（x±s）Table9 Theeffectof lactoferrin（UHP）on theactivity of NK cells inm ice（x±s）

由表9可以看出，各剂量组与0 g/kg组相比对小鼠NK细胞活性的影响上无统计学差异。

3 结果与讨论

小鼠经口给予乳铁蛋白液（超高压）30天后，100 mg/kg受试物可以增强小鼠脾脏产生抗体的细胞数目，同时10mg/kg和100mg/kg受试物还增加了血清中特异性抗体的滴度，因此判断该受试物具有增强细胞免疫功能的能力。但是处理与未处理的乳铁蛋白在相同剂量下的作用，不完全一致，故认为二者差异不明显。100mg/kg受试物能够增强小鼠的迟发型变态反应和T淋巴细胞增殖能力，故判断该受试物具有增强体液免疫功能的作用。1.67、10mg/kg和100mg/kg的受试物增强小鼠的碳粒廓清指数，同时100mg/kg受试物能促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光胶珠的能力，因此判断该受试物具有促进巨噬细胞吞噬的能力。各个剂量组小鼠的NK细胞活性与溶剂对照组相比未见明显增强。

近些年对于乳铁蛋白辅助增强免疫力的研究也特别多，有动物和人体的研究。如2010年胡志和研究团队，经过研究发现2、20、200mg/kg·d增强免疫力的实验结果均为阳性，且20mg/kg·d最为显著[12]。王艳萍[13]对乳铁蛋白牛奶进行了人体试食研究，对上海和北京俩地志愿者食用含有不同剂量（5mg/100mL和10mg/100mL）乳铁蛋白牛奶产品，实验发现食用两种不同剂量乳铁蛋白牛奶产品的志愿者，在流感症状发生率、发生次数、症状持续天数、症状严重度、药物治疗天数和病假天数上均显著低于安慰剂组志愿者，表明加入乳铁蛋白的牛奶产品对提高志愿者免疫力水平有明显作用。Petra Hellwega[14]用18只比格猎犬进行免疫评价，通过口服分别设置0、120、1 800mg/kg乳铁蛋白喂养四个星期，结果发现口服牛奶乳铁蛋白明显的影响狗的细胞免疫功能并能够降低粪便中大肠菌及产气荚膜菌的数量。本研究结果与胡志和研究结果在低剂量组有差异，其研究发现剂量为2 mg/kg·d即有免疫增强作用，而本研究10mg/kg·d仍未发现免疫增强作用，本研究与Pope研究结果相似，Pope[15]研究发现60、120mg/d乳铁蛋白进行狗的喂养实验，未发现减少大肠菌群以及影响免疫功能。同时研究发现，超高压对功能有一定的影响，但无显著差异。乳铁蛋白增强免疫的原理及功效量仍需要进一步研究。

综上所述，本研究证明在一定剂量下超高压处理乳铁蛋白具有提高免疫力的功效，同时研究对比发现含量较低的乳铁蛋白不能达到增强免疫力的功能，超高压对乳铁蛋白的功能有一些影响，超高压后的乳铁蛋白结构的变化与功能的变化仍待进一步研究。

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Study on the Enhancing Immunity Function of Lactoferrin by Ultre High Pressure Processing

CHENWei1，CHENYun1，LIUYu1，LIZhi-wei1，SHIYu-dong1，WEIXue-tao2，MUZhi-shen1，*
（1.InnerMongoliaMeng Niu Dairy Industry（Group）Co.，LTD，Hohhot011500，InnerMongolia，China；2.SchoolofPublic Health，PekingUniversity，Beijing100191，China）

To study the function ofenhancing immune of lactoferrin by ultra high pressure proceed.Methods：Healthy femalemice ofB1/Fqwasas the research subjects，setting five doesgroupswith 1.67，10，100mg/kg·bw（lactoferrinwasproceed by ultrahigh pressure），and 0，10mg/kg·bw（lactoferrinwithoutultrahigh pressure）. themicewere given once a day bymonthwith the appropriate concentration of tested samples.Then theweight，thymus，spleen organ，ConA-induced spleen lymphocyte proliferation，RBC-induced DTH，the number of hemolytic plaque，halfofhemolytic serum（HC50），carbon clearance ability，macrophage phagocytosisof chicken erythrocytes，NK cellactivitywere detected onemonth with the tested samples.100mg group were significantly higher than control group（P<0.05） in humoral immunity，cellular immunity function，promote macrophage phagocytic function，socan judge the 100mg dose group can be judgeenhanced immune function in mice.The resultsshowed that lactoferrin（UHP）stillhad enhancing immune function.

lactoferrin；ultrahigh pressure（UHP）；animal clinical trial；enhancing immune

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.039

2016-08-31

内蒙古自治区科技计划项目（201502056）

陈伟（1980—），男（汉），工程师，硕士研究生，从事乳制品及其功能研究工作。

*通信作者：母智深，从事于乳制品研究及管理工作。