紫外可见光谱法测定食醋中4-甲基咪唑含量

陈岩，赵宇明

（大连市食品检验所，辽宁大连116630）

紫外可见光谱法测定食醋中4-甲基咪唑含量

陈岩，赵宇明*

（大连市食品检验所，辽宁大连116630）

建立紫外可见光谱法测定食醋4-甲基咪唑的方法。结果表明，食醋样品经沉淀、离心、萃取、脱色及显色反应后，4-甲基咪唑经重氮偶合后在波长440 nm处具有最大吸收，据此进行定量测定。方法的线性方程为：A=13.721C+ 0.008 9，线性相关系数为0.999 7，检出限为1.2μg，方法的平均回收率为95%～105%，本方法的标准偏差为1.97×10-5～9.37×10-5，变异系数为0.002～0.008。

食醋；4-甲基咪唑；重氮偶合；紫外可见光谱法

焦糖色素是迄今为止用量最大的天然色素，广泛应用于食醋、酱油、酒类、酱腌菜、糕点、巧克力、糖果、糖浆药等行业中，我国食品添加剂使用标准GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中规定除特殊要求外，其按生产需要适量使用[1]。4-甲基咪唑（4-methylimidazole）是以氨（铵）法生产焦糖色过程中产生的具有一定毒性的副产物。4-甲基咪唑具有强烈的惊厥作用甚至可以诱发癫痫病[2]，对雄性小鼠的致死量为307mg/kg体重，同时，可以诱发老鼠患肺癌和白血病。国家标准GB 1886.64-2015《食品安全国家标准食品添加剂焦糖色》[3]中明确规定焦糖色（亚硫酸法、氨法、普通法）中4-甲基咪唑的含量不得超过0.02%。

在食醋中普遍使用焦糖色进行调色，特别是在陈醋中，生产企业使用量更高。不合格焦糖色的使用或合格焦糖色的过量添加，都会给食醋产品带来一定的潜在风险。焦糖色中4-甲基咪唑的测定方法有薄层色谱法[4]、纸层析法[5]、离子色谱法[6]、高效液相色谱法[7-10]、填充柱气相色谱法[11-12]、毛细管等速电泳法[13]、分光光度法[14-15]、高效液相色谱-串联质谱法[16]等。目前，利用紫外可见光谱法对食醋中4-甲基咪唑含量定量分析还鲜见报道，本文建立了采用紫外可见光谱法测定食醋中4-甲基咪唑含量的方法，获得满意的分析结果，为规范食醋生产提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

三氯甲烷、无水乙醇、盐酸、硫酸、亚硝酸钠、对氨基苯磺酸、碳酸氢钠、乙酸铅等：均为分析纯试剂，购于天津市科密欧试剂有限公司；4-甲基咪唑标准品（98%）：美国Acros Organicss公司；实验室用水为二次蒸馏水。

UV2550型紫外可见分光光度计：日本岛津公司；EK-600H型电子天平：广州东华科学仪器公司；HM-120型电子天平：广州东华科学仪器公司；PHS-3C型酸度计：上海伟业仪器厂。

1.2 溶液配制

标准溶液：准确称取4-甲基咪唑0.100 0 g，置于100mL容量瓶中，加入10%碳酸氢钠溶液10mL，加水定容至刻度，得浓度为1mg/mL的4-甲基咪唑标准储备液，放于冰箱中备用。

重氮化试剂：0.5%对氨基苯磺酸的2%盐酸溶液与0.5%的亚硝酸钠溶液等量混合。

1.3 方法

1.3.1 样品的提取

在聚四氟乙烯离心管中称取5.00 g样品，加20 g/L的乙酸铅溶液5mL，放置10min沉淀蛋白质。将离心管在6 000 r/min下离心5min，将清液转移到烧杯中，用3mol/L的NaOH溶液调pH值至11.0。将溶液过滤到250mL分液漏斗中，用150mL三氯甲烷/乙醇溶液（体积比4∶1）分3次（70、40、40mL）提取溶液，将三氯甲烷层合并到另一洁净的分液漏斗中。在三氯甲烷层的分液漏斗中加入35mL硫酸溶液（0.05mol/L），分两次（20、15mL）提取目标物，将水层合并到烧杯中，加入2 g活性炭振摇数次，将滤液过滤到容量瓶中，用水定容。

准确吸取上述滤液1mL，置于10毫升比色管中，加入重氮化试剂1 mL，加入10%碳酸氢钠溶液0.5 mL，充分混合均匀，放置1min，加水至10mL，混匀。在室温下放置10min～15min后，以试剂空白为参比，于波长440 nm处测定溶液吸光度。

1.3.2 标准曲线

准确吸取1 mg/mL的4-甲基咪唑标准储备液0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL（分别相当于0.00、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg 4-甲基咪唑），置于10mL比色管中，加水至1.0mL，加重氮化试剂1mL，再加入10%碳酸氢钠溶液0.5mL，充分混匀，反应1min后，加水至刻度，充分摇匀。在室温下放置10min～15min，于波长440 nm处测定溶液吸光度。以4-甲基咪唑浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.3 结果计算

样品中4-甲基咪唑的含量（%）的计算公式：

式中：X为样品中4-甲基咪唑的含量，%；c为测得样品溶液的吸光度从标准曲线查得相应的含量，mg；m为样品质量，g；V为样品最终定容的体积数，mL。

2 结果与分析

2.1 试验原理

4-甲基咪唑与重氮化试剂的重氮偶合反应是4-甲基咪唑阴离子与亲电试剂在碱性水溶液中反应，由于负电荷从1-位离域到3-位，使得反应发生在2-位。偶合后得到橘黄色到棕红色偶合物，用紫外可见光谱法进行比色定量。

2.2 测定波长的选择与吸收光谱

按试验方法，在350 nm～650 nm处进行波长扫描，结果见图1。

图1 不同工作波长下4-甲基咪唑的吸光度值（吸收光谱）Fig.1 4-methyl im idazoleunder differentworkingwavelength absorbance value（absorption）

吸光度在410 nm～440 nm内逐渐增加，在440 nm达到最大，之后吸光度逐渐下降，因而选择440 nm作为工作波长。方法的标准曲线见图2。

图2 标准曲线Fig.2 Standard curve

2.3 适宜的反应条件

2.3.1 介质的选择

不同介质所提供的酸碱性环境对萃取效果的影响不同，4-甲基咪唑在pH＞7的条件下溶解于有机试剂，在pH＜7的条件下溶解于水，因而提取时应将样品溶液的pH值调控到适宜的范围才能确保萃取效果最佳。在pH 9.0～13.5区间范围内考察4-甲基咪唑的回收率，结果见图3。

图3 不同pH值对萃取效果的影响Fig.3 The influenceof different pH valueon theextraction effect

图3 表明，当样品溶液的pH=11.0时，4-甲基咪唑的回收率最高，即萃取的效果最好，因此选择样品溶液的最佳pH值为11.0，最佳介质为NaOH溶液。

2.3.2 反应时间和温度的选择

反应时间和温度的选择试验结果见表1。

表1 反应时间和温度的选择Table1 Choiceof reaction tim eand tem perature

由表1可见，反应时间过短，溶液显橘黄色，本偶联反应在室温条件下10min以上才能充分完成，试验选择在室温下放置10min～15min。在环境温度明显低于室温条件下，改用恒温水浴调节温度在20℃～25℃之间，保温10min～15min。

2.3.3 染料的稳定性

本染料形成后，在适宜的介质中5 h内溶液显棕红色，吸收特征无变化。样品溶液稳定，适合直接测定。

2.4 方法准确度的确定

取3种不同品牌的食醋进行加标，按试验方法显色测定4-甲基咪唑的回收率，考察方法的准确度，结果见表2。

由表2可见，3种食醋样品中，4-甲基咪唑均不同程度检出。本测定方法的回收率为95%～105%，准确度较高。

2.5 方法精密度的确定

按试验方法，平行测定6个食醋样品各10次，对测得结果进行数据处理，计算出标准偏差S和变异系数C.V%，考察该方法的精密度，结果见表3。

表2 测定方法的准确度试验结果Table2 Theaccuracy of determ inationm ethod of the experimental results

表3 测定方法的精密度Table3 The determ ination of thep recision of themethod

由表3可见，本方法的标准偏差为1.97×10-5～9.37× 10-5，变异系数为0.002～0.008，精密度较高。

3 结论

利用紫外可见光谱法测定食醋中4-甲基咪唑，方法的检出限为1.2μg，方法的平均回收率为95%～105%，本方法的标准偏差为1.97×10-5～9.37×10-5，变异系数为0.002～0.008。方法操作简便易行，可以获得良好的重现性，并且灵敏度高，为食醋中4-甲基咪唑的检验提供了一种切实可行的分析方法，具有一定的推广价值。

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Determ ination of 4-M ethyl Im idazole Content in Vinegar by Uv-vis Spectrometry

CHENYan，ZHAOYu-ming*
（Dalian Institute for Food Control，Dalian 116630，Liaoning，China）

Themethod on determination of 4-methyl imidazole in vinegar by uv-vis spectrometry was established in thisstudy.The experimental results showed that：by precipitation，centrifugal，extraction，decolorizingand chromogenic reaction，4-methyl imidazole in the vinegarsampleshas themaximum absorption inwavelength of440 nm by diazo coupling and the quantitative determination was conducted on the basis of that.The linear equation was：A=13.721C+0.008 9，the linear correlation coefficientwas0.999 7，the detection limit was 1.2μg，the average recoverywas95%-105%，the standard deviation was1.97×10-5-9.37×10-5and the variation coefficientwas0.002-0.008.

vinegar；4-methylimidazole；diazo coupling；uv-visible spectrometry

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.030

2016-05-27

大连市食品协会基金资助项目（K20150629091408）

陈岩（1982—），女（汉），工程师，硕士，主要从事食品检验与方法研究。

*通信作者：赵宇明（1977—），男（汉），高级工程师，硕士，主要从事食品检验与方法研究。