MTDH和HIF-1α在复发转移性乳腺癌表达及其临床意义的研究*

靳 鹏 缪玉娥 衣启军 马 莉 刘海燕 谢晓冬

(泰山医学院附属医院肿瘤科，山东 泰安 271000)



MTDH和HIF-1α在复发转移性乳腺癌表达及其临床意义的研究*

靳 鹏 缪玉娥 衣启军 马 莉 刘海燕 谢晓冬

(泰山医学院附属医院肿瘤科，山东 泰安 271000)

目的 检测乳腺癌患者病理组织及外周血中MTDH和HIF-1α的表达情况，以及与乳腺癌临床病理参数的相互关系。方法 采用细胞免疫化学、免疫组化、流式细胞术分别对乳腺癌细胞系、病理组织及外周血进行检测。结果 (1)MTDH主要表达于乳腺癌细胞的细胞膜与细胞浆，在组织中少部分表达于细胞核，HIF-1α主要表达于细胞浆与细胞核；(2)在免疫组化检测中，MTDH阳性率为63.3%，HIF-1α阳性率为23.3%；(3)MTDH表达情况与肿瘤的临床分期(P=0.010)、转移部位(P=0.003)、疾病进展时间(TTP)(P=0.002)有相关性，与年龄、原发淋巴结转移、HER-2、ER、PR等无相关性，HIF-1α的表达情况与乳腺癌病理参数均无明确相关性。MTDH与HIF-1α线性回归系数R=0.365，P<0.05有统计学意义。结论 在MTDH和HIF-α与乳腺癌复发转移有明确相关性，对乳腺癌的疾病进展有着重要的作用。

MTDH；HIF-1α；乳腺癌；血管生成

乳腺癌是近年来严重影响中国女性健康的疾病之一，其复发转移是最主要的死亡原因，因此控制复发转移对降低乳腺癌患者的死亡率具有决定性作用。异黏蛋白(metadherin，MTDH，LYRIC，AEG-1和3D3)最早是在感染了人免疫缺陷病毒(HIV-1)的人原始胚胎星形细胞中被克隆出来的[1]，在肿瘤组织中高表达。缺氧诱导因子-1a(hypoxia-inducible factor-1 alpha, HIF-1α)是肿瘤细胞在缺氧条件下产生的一种核转录因子，能够调节细胞的能量代谢和氧的运输，使细胞适应低氧状态，是维持体内细胞内氧平衡的主要调控因子[2]。HIF-1α还可以通过调节肿瘤蛋白的表达、肿瘤血管的生成，促进肿瘤的疾病进展及复发转移[3]。本研究旨在明确MTDH及HIF-1α在复发转移乳腺癌中的表达情况，重点探讨其在复发转移中的作用及相互关系。

1 材料与方法

1.1 标本

1.1.1 组织标本 本研究选取乳腺癌石蜡组织及外周血样本30例，来自泰山医学院附属医院肿瘤科2012年12月—2015年10月收治的乳腺癌患者，均于2006年1月—2015年12月行乳腺癌手术治疗。其中21例患者为复发转移患者，9例为原发乳腺癌患者，均为女性，中位年龄56岁(27～69岁)，所有患者均经过术后化学治疗，部分患者接受局部放射治疗及内分泌治疗。本研究组织样本来自于泰山医学院附属医院病理科乳腺癌患者术后存档标本，所选标本病理及组织分型均经确认，具有完整的病例资料。

1.1.2 细胞标本 本研究选取三种乳腺癌细胞株，分别是MCF-7(ER阳性乳腺癌细胞株)、SK-BR3(HER-2过表达乳腺癌细胞株)、MDA-MB-231(三阴乳腺癌细胞株)，均购自中科院上海细胞研究所，于沈阳军区总医院医学实验科细胞培养室培养。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 用含有10 ml预热的含有10%标准胎牛血清和青霉素(浓度为100 U/ml)、链霉素(浓度为0.1 mg/ml)双抗改良RPMI1640培养基的培养瓶中，37 ℃，5%CO2培养箱中传代培养。

1.2.2 细胞免疫化学 采用免疫细胞化学方法检测三种乳腺癌细胞中MTDH、HIF-1α的表达情况，采用免疫组化SP法检测乳腺癌病理组织样本中MTDH、HIF-1α的表达情况抗体分别购自美国Invitrogen公司、武汉博士德公司；PBS作为阴性对照，已知阳性切片为阳性对照。

结果判定：(1)染色程度：不着色为0分，呈淡黄色为1分，呈黄色为2分，呈棕褐色为3分；(2)阳性染色细胞百分比：阳性细胞<25%为0分，25%～50%为1分，50%～75为2分，>75%为3分；(3)前两项评分结果相加后，评分0～1分为阴性，评分>2分为阳性。

1.2.3 外周血流式细胞术 采用流式细胞术的方法检测细胞株及外周血单个核细胞中MTDH、HIF-1α的含量，抗体分别购自美国Invitrogen公司、武汉博士德公司；PBS作为阴性对照。

1.3 统计学方法

本研究采用SPSS17.0统计软件进行分析，研究中计量资料采用均数表达，组内计数资料比较采用χ2检验，组间计量资料比较采用t检验，相关性分析采用Pearson分析，相关系数r表示，P≤0.05有统计学意义。

2 结 果

2.1 MTDH和HIF-1α在乳腺癌细胞系及组织的表达情况

细胞免疫化学检测发现，MTDH主要表达于细胞膜与细胞浆；HIF-1α主要表达于细胞核与细胞浆(图1～3)。免疫组化检测发现MTDH大部分表达在肿瘤组织的细胞膜与细胞浆，阳性率为56.3%，少部分表达位于细胞核。HIF-1α主要表达于乳腺癌细胞核与细胞浆中，阳性率为23.3%。

2.2 MTDH和HIF-1α的表达与临床病理参数的关系

MTDH的表达情况与病理分型、Ki67以及P53的表达、转移的部位、TTP有相关性(P<0.05)，与年龄、手术前淋巴结转移、激素受体情况无相关性(P>0.05)(见表1、2)。原发乳腺癌患者MTDH表达率为44.4%，复发转移乳腺癌患者MTDH基因表达率为71.4%(P<0.05)。在免疫组化研究中HIF-1α阳性表达的患者仅有7例，表达阳性率为23.8%。其中7例阳性患者中，有71.4%的患者发生了远处转移。HIF-1α表达情况与乳腺癌临床病理参数分析中均无临床统计学意义。

2.3 复发转移乳腺癌中MTDH和HIF-1α表达的关系

细胞免疫化学结果显示在三种乳腺癌细胞系中MTDH和HIF-1α表达均为阳性，在免疫组化检测中7例患者出现HIF-1α阳性。其中6例患者MTDH阳性表达。在流式细胞术的检测中， MTDH的表达量为(7.78±5.79)(P=0.023)，HIF-1α的表达量为(33.42±25.41)(P=0.000)，均有统计学意义。分组比较中，MTDH和HIF-1α存在线性相关，相关系数R=0.365，P<0.05，有统计学意义(见表3)。在MTDH、HIF-1α表达情况与乳腺癌复发转移比较中发现，P<0.05，有统计学意义(见表4)。(见图5～8)

图1 MTDH和HIF-1α在乳腺癌细胞系MCF-7中的表达情况

图2 MTDH和HIF-1α在乳腺癌细胞系SK-BR3中的表达情况

图3 MTDH和HIF-1α在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中的表达情况

图4 MTDH和HIF-1α在乳腺癌组织中的表达情况

表1 MTDH和HIF-1α在乳腺癌组织中的表达情况与临床资料的比较

表2 MTDH和HIF-1α在乳腺癌组织中的表达情况与病理资料的比较

表3 MTDH和HIF-1α流式细胞术检测外周血中表达情况

在Pearson相关分析结果中r=0.365，P=0.047，MTDH与HIF-1α存在线性相关。

MTDH阳性表达的结果根据免疫组化结果判定；HIF-1α阳性表达的结果根据HIF-1α在流式细胞术检测中阳性表达率来判定，当阳性率>10%时为HIF-1α阳性。

表4 流式细胞术检测原发与复发转移性乳腺癌外周血中MTDH和HIF-1α表达情况及其关系

图5 流式细胞术检测MTDH和HIF-1α在乳腺癌外周血中的表达情况

图6 流式细胞术检测MTDH和HIF-1α在MCF-7中的表达情况

图7 流式细胞术检测MTDH和HIF-1α在SK-BR3中的表达情况

图8 流式细胞术检测MTDH和HIF-1α在MDA-MB-231中的表达情况

3 讨 论

MTDH是一种高碱性的Ib性的跨膜蛋白，其编码基因主要定位于染色体8q22[4]，对肿瘤的发生发展有重要的作用[5]。MTDH蛋白表达于细胞浆、内质网、细胞核周边及核仁，还有研究发现细胞浆及细胞膜亦有表达[1]。本研究验证这一结果。MTDH表达位置可能受到TNF-α、HIF-1α等基因影响[6-7]，使其与P53相互作用促进肿瘤细胞的增殖[8-9]。此外，MTDH基因能够加强乳腺癌细胞在肺组织的锚定能力，进一步增强乳腺癌发生肺转移可能性[1]。MTDH基因的扩增可以显著加速小鼠乳腺癌细胞肺转移速度，进而缩短小鼠的生存时间[6]。

缺氧是实体肿瘤微环境的基本特征之一。肿瘤细胞为了适应缺氧环境，从而发生了一系列的生物学特性改变，这一过程中缺氧诱导因子HIF-1α起到了核心性的作用[10]。研究发现HIF-1α主要表达于细胞浆和细胞核。在缺氧状态下，HIF-1α调节VEGF的表达，促进新生血管的生成以维持肿瘤的生长，同时接受肿瘤因子或缺氧微环境的上调反馈，形成恶性循环。缺氧可以诱导葡萄糖利用率的加快，葡萄糖储备的减低进一步使MTDH表达增强。Meng X[11]认为MTDH过表达时可以诱导HIF-1α、Tie2以及VEGF的表达，使肿瘤组织的缺氧状态得到进一步增强，从而实现缺氧正反馈调节。

在肿瘤缺氧过程中，HIF-1α在细胞核内将与靶基因启动子的缺氧反应原件结合，促进肿瘤的生长、转移，血管的生成以及机体的能量代谢。在神经胶质瘤的研究中发现，进行HIF-1α基因敲除后，MTDH的表达明显降低，可以有效地预防肿瘤的转移。本研究证实MTDH和HIF-1α的表达存在着相关性。

综上所述，MTDH和HIF-1α作为已知的两种肿瘤相关预后因子，不仅能为预测乳腺癌疾病进展提供可能的监测指标，还可能为治疗复发转移性乳腺癌提供可能的新靶点。

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The expression and the clinical significance of MTDH and HIF-1α in metastasis breast cancer

JIN Peng MIAO Yu-e YI Qi-jun MA Li LIU Hai-yan XIE Xiao-dong

(Dept.of Oncology, Affilliated Hospital of Taishan Medical University, Taian 271000,China)

Objective: The objective is not only to detect the expression of MTDH and HIF-1α with the pathological tissues in metastasis breast cancer but also to study on interaction with MTDH, HIF-1α and clinical information of breast cancer.Methods: Cellular immunochemical, Immunohistochemical assay, flow cytometry (FCM) are used respectively to detect the expression of MTDH and HIF-1α protein in breast cancer cell line MCF-7, breast cancer cell line MCF-7, MDA-MB-231 and the peripheral blood.Results: (1) MTDH describes largely the cellular membrane and the cytoplasm of breast cancer cells, while only a few of MTDH of pathological tissues may illustrate the cell nucleus.Meanwhile, HIF-1α is used for explaining the cytoplasm and the cellular nucleus.(2) In immunohistochemical study, the positive rates of MTDH in breast cancer patients is 63.3%, and the positive rates of HIF-1αin breast cancer patients is 23.3%.(3) The correlation is existed between the expression of MTDH in breast cancer with the clinical stage(P=0.010)、the metastatic sites(P=0.003), time to progression(P=0.002) rather than with patients age, lymph node metastasis, ER, PR and HER-2.The expression of HIF-1α had no explicit correlation with the clinical pathological parameters of the breast cancer patients.There is certian staisstical significance between MTDH with HIF-1α(R=0.365,P<0.05).Conclusions: This paper showed that Significant correlation was found between the MTDH 、HIF-1α for the metastasis and the angiogenesis of breast cancer.MTDH gene and HIF-1α gene may play important roles in breast cancer.

MTDH; HIF-1α; breast cancer; angiogenesis

辽宁省自然科学基金项目(20082070)。

靳鹏(1984—)，男，山东泰安人，硕士，教授，硕士生导师，主要从事临床肿瘤科工作。通讯作者：刘海燕，女，山东泰安人，硕士，教授，硕士生导师，主要从事实体瘤肿瘤综合治疗及科研教学工作。

谢晓冬，男，辽宁沈阳人，硕士，教授，博士生导师，主要从事实体瘤肿瘤综合治疗及科研教学工作。

R730

A

1004-7115(2016)10-1081-05

10.3969/j.issn.1004-7115.2016.10.001

2016-07-22)