HPLC-DAD法同时测定糖痹康中6种主要活性成分

魏 颖，王东超，高佳琪，秦灵灵，孙 文，张 岩，石浩霞，兰 卫，徐暾海*，刘铜华

(1.北京中医药大学中药学院，北京 100029；2.北京中医药大学中医养生学北京市重点实验室，北京 100029；3.北京中医药大学中医养生学教育部重点实验室，北京 100029；4.新疆医科大学中医学院，乌鲁木齐 830011)



HPLC-DAD法同时测定糖痹康中6种主要活性成分

魏 颖1,2,3，王东超1,2,3，高佳琪1,2,3，秦灵灵2,3，孙 文2,3，张 岩2,3，石浩霞1,2,3，兰 卫4，徐暾海1,2,3*，刘铜华2,3

(1.北京中医药大学中药学院，北京 100029；2.北京中医药大学中医养生学北京市重点实验室，北京 100029；3.北京中医药大学中医养生学教育部重点实验室，北京 100029；4.新疆医科大学中医学院，乌鲁木齐 830011)

目的 研究糖痹康颗粒6种活性成分的含量同时测定的方法。方法 采用HPLC-DAD法测定糖痹康颗粒中6种活性成分的含量，C18色谱柱(150 mm,4．6 mm,5 μm),0．1%甲酸与水-0．1%甲酸与乙腈(18%～60%)梯度洗脱；检测λ为多波长检测分别是:196、201、202、204、276、228 nm；用标准曲线法测定。结果 6种活性成分在5 ～ 600 μg/mL范围内线性关系良好，回归方程分别为:芍药苷：Y=227 988X+182，R2=0．999 1；毛蕊异黄酮葡萄糖苷：Y=417 929X-213，R2=0．999 7；特女贞苷：Y=199 569X-312，R2=0．998 3；迷迭香酸：Y=364 936X+152，R2=0．998 1；黄芩苷:Y=64 131X+362,R2=0．999 4；小檗碱：Y=87 882X+111，R2=0．999 5。6种活性成分的加样回收率分别为：芍药苷：101．44%(RSD=0．48%)；毛蕊异黄酮葡萄糖苷：99．99%(RSD=0．43%)；特女贞苷102．07%(RSD=0．57%)；迷迭香酸：98．38%(RSD=0．46%)；黄芩苷：102．71%(RSD=0．485%)；小檗碱：99．54%(RSD=0．77%)。结论 所建立含量测定方法简便、快捷、可靠，可用于糖痹康颗粒的质量控制。

糖痹康颗粒；活性成分；HPLC-DAD；含量测定

糖尿病(DM)是世界上发病率最高的疾病之一，以持续高血糖为基本生化特征的一种综合性疾病，严重威胁人类生命[1-5]。糖尿病周围神经病变(DPN)是糖尿病常见并发症之一，其发病机制十分复杂，并非单一因素所致。本课题组通过大量的前期研究[6-15]表明：糖痹康颗粒用于治疗糖尿病周围神经病变具有很好的疗效。课题组组长刘铜华教授经过多年的临床研究，认为本病主要病机为“气阴不足，毒瘀神络”，并在国内外首次提出“益气养阴、解毒化瘀通络”的新治疗原则。中药复方糖痹康是在这一治则指导下,在传统经方黄芪桂枝五物汤基础上，结合现代研究成果和临床经验创制的，先后经多年临床验证，不断优化处方，其组方及制备工艺已成功申报发明专利(专利申请号:200810167551．1)。本实验通过对糖痹康中前期研究锁定的6种主要活性成分的含量测定方法进行研究,旨在有效的对复方中药糖痹康颗粒进行质量评价,实验结果表明，该方法可有效的控制糖痹康颗粒的质量。

1 仪器与试药

仪器：岛津LC-15C高效液相色谱仪(四元泵，恒温柱箱，DAD检测器，LC solution工作站，岛津公司，日本)；FY130型中药粉碎机(天津市亲斯特仪器有限公司)；Millipore-Q超纯水制备仪(法国密理博公司)；KQ-250B型高功率超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DF-101S集热恒温加热磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司)；德国赛多利斯电子分析天平(R200D分析天平)。

材料与试剂：芍药苷(LOT:B21148，购自上海源叶生物科技有限公司)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(LOT:PM0515SA13，购自上海源叶生物科技有限公司)、特女贞苷(LOT:Z21S3B1，购自上海源叶生物科技有限公司)、迷迭香酸(由中国药品生物制品检定所提供，批号为111871-201203)、黄芩苷(LOT:RM0523FA14，购自上海源叶生物科技有限公司)、小檗碱(LOT:Y11A6W1,购自上海源叶生物科技有限公司)，6种标准品含量均≥98%，符合含量测定要求；乙腈(色谱纯)为美国Fisher Scientific公司产品；甲酸(色谱纯)为美国Fisher公司产品；糖痹康颗粒北京中医药大学药厂制备(由黄芪、女贞子、桂枝、赤芍、黄芩、黄连、水蛭等组成，每克颗粒剂相当于3．61 g生药)。

2 方法与结果

2．1 色谱条件 Thermo Syncronis C18色谱柱(150 mm×4．6 mm，5 μm)；流动相：0．1% 甲酸与水-0．1%甲酸与乙腈(18%～60%)30 min；柱温38 ℃，流速1．0 mL/min，进样量20 μL，检测λ为多波长检测分别是：196、201、202、204、276、228 nm。

2．2 溶液的制备

2．2．1 对照品储备液制备 分别精密称取标准品芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、特女贞苷、迷迭香酸、黄芩苷、小檗碱，1．023、1．521、1．302、1．125、1．146、1．002 mg，加甲醇配制成1 mg/mL标准品储备液。冷藏，避光备用。

2．2．2 供试品溶液制备 精密称取3．00 g糖痹康颗粒，置于具塞锥形瓶中，精密加入90%甲醇100 mL(超声处理功率90 W，频率59 Hz，30 min)，过滤，旋干，再加入20%甲醇100 mL(超声处理功率90 W，频率59 Hz，30 min)，加入至上述旋瓶中旋干，50%甲醇定容至15 mL，过滤，取续滤液。

2．3 系统适用性考察 分别吸取对照品溶液、供试品溶液、空白对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪，在“2．1．1”条件下测定。芍药苷：理论踏板数，分离度；毛蕊异黄酮葡萄糖苷理论踏板数，分离度；特女贞苷：理论踏板数，分离度；迷迭香酸：理论踏板数，分离度；黄芩苷：理论踏板数，分离度；小檗碱：理论踏板数，分离度均符合含量测定要求。

2．4 线性关系考察 将“2．1．2”项下对照品储备液用20%甲醇逐级稀释成不同浓度的对照品溶液，浓度依次为10、25、50、100、250、500 μg/mL，精密吸取对照品溶液各20 μL，在“2．1．1”项色谱条件下进样测定，记录峰面积，以对照品浓度(X)为横坐标，以峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程分别为芍药苷：Y=227 988X+182，R2=0．999 1；毛蕊异黄酮葡萄糖苷：Y= 417 929X-213，R2=0．999 7；特女贞苷：Y=199 569X-312，R2=0．998 3；迷迭香酸：Y=364 936X+152，R2=0．998 1；黄芩苷：Y=64 131X+362，R2=0．999 4；小檗碱：Y=87 882X+111，R2=0．999 5，线性范围均为5～600 μ/mL。

2．5 精密度试验 精密吸取一定浓度混和对照品溶液，连续进样6次，RSD分别为，芍药苷：0．91%；毛蕊异黄酮葡萄糖苷：1．86%；特女贞苷0．40%，迷迭香酸：1．53%；黄芩苷：1．24%；小檗碱：0．19%，均<2．0%，表明仪器精密度良好。

2．6 稳定性试验 按“2．1．3”项操作制备供试品溶液，常温放置，在“2．1．1”项色谱条件下测定，分别于0、2、4、12、24 h进样，每次20 μL，记录峰面积，样品中各成分不同时间测定的峰面积RSD分别为，芍药苷：1．10%；毛蕊异黄酮葡萄糖苷：1．45%；特女贞苷：0．76%；迷迭香酸：1．83%；黄芩苷：1．44%；小檗碱：0．63%，均<2．0%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2．7 重现性试验 精密称取糖痹康颗粒6份，分别按照“2．1．3”项操作制备供试品溶液，按“2．1．1”项色谱条件分别测定。计算样品中待测成分的含量，结果 RSD分别为，芍药苷：1．86 %；毛蕊异黄酮葡萄糖苷：2．08%；特女贞苷：1．94%，迷迭香酸：1．67 %；黄芩苷：1．58%；小檗碱：1．79%，证明重复性良好。

2．8 回收率试验 精密称取已知含量同一批次供试品6份，每份取样量为供试品取样量的50%，约1．50 g。以当前取样含量的1∶1，分别精密加入芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、特女贞苷、迷迭香酸、黄芩苷、小檗碱，按“2．1．3”项操作制备，按“2．1”项色谱条件测定。计算得平均回收率及RSD。见表1。

2．9 样品含量测定 取样品3批，按“2．2．2”和“2．2．3”项下的方法制成对照品溶液与供试品溶液，按“2．2．1”方法测定6种主要活性成分。结果表明，糖痹康颗粒中6种活性成分的平均含量：芍药苷9 360.68 μg/g；毛蕊异黄酮葡萄糖苷3 070.71 μg/g；特女贞苷2 208.47 μg/g；迷迭香酸1 598.81 μg/g；黄芩苷27 267.82 μg/g；小檗碱量443.87 μg/g。

表1 6种活性成分加样回收率实验(n=6)

续表1

成 分序号称样/g样品中量/μg加入量/μg测的量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%黄芩苷11.502140958.984100083917.80104.78105.460.9321.521441485.254100084918.57105.9331.513641272.564100084740.74106.0241.513841278.024100085083.70106.8451.543242079.694100084774.52104.1361.565142676.864100085752.04105.06小檗碱11.5021666.746601319.0498.8399.071.5621.5214675.306601330.5099.2731.5136671.846601319.7298.1641.5138671.936601310.3596.7351.5432684.986601347.67100.4161.5651694.706601361.48101.03

3 小结

中药复方糖痹康经多年临床证实对DPN具有良好疗效，总有效率可达93．39%。HPLC中药制剂分析法是质量分析中最常用的方法[16]。中药复方糖痹康颗粒为中医理论指导下的治疗胰岛素抵抗的临床经验方，由黄芪、女贞子、桂枝、赤芍、黄芩、黄连、水蛭、鸡血藤、延胡索(醋制)等中药提取物组成。对于糖尿病周围神经病变有很好的疗效,本课题组采用HPLC-DAD法对其6种主要活性成分芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、特女贞苷、迷迭香酸、黄芩苷、小檗碱同时测定的含量测定方法进行研究。该方法样品处理简单、可控。色谱条件简单，在样品得到较好分离的基础上，尽量减少了分析所用的时间，有很好的实用性。该方法准确可靠,可用于本品的内在质量控制。本实验建立了同时测定糖痹康颗粒中6种主要活性成分的HPLC-DAD的含量测定方法,可以快速、有效的对糖痹康颗粒进行质量控制。

[1]ARONSON D.Hyperglycemia and the pathobiology of diabetic complications[J].Advances in Cardiology,2008(45):1-16.

[2]杨金奎.糖尿病并发症发病机制新认识——2007年第43届欧洲糖尿病学会年会专题报告解读[J].国际内分泌代谢杂志,2008,28(1):18-21.

[3]郑玲,刘秋爽,金晶,等.糖尿病并发症治疗靶点的研究进展[J].海峡药学,2014,26(1):13-17.

[4]何永静.老年糖尿病并发症的临床分析[J].当代医学,2012,18(31):53-54.

[5]王月娟.2型糖尿病患者患病情况及慢性并发症的相关因素分析[D].长春:吉林大学,2015.

[6]穆晓红,刘铜华,秦灵灵,等.从血液流变学和坐骨神经传导速度评价中药糖痹康对大鼠糖尿病周围神经病变的影响[J].中华中医药杂志,2012,27(2):378-381.

[7]张宏,刘铜华.糖痹康对高糖损伤人脐静脉内皮细胞的保护作用[J].中华中医药学刊,2012,30(6):1248-1251.

[8]王佳,刘铜华.糖痹康对糖尿病周围神经病变大鼠坐骨神经传导速度的影响[J].中国中医基础医学杂志,2010,16(3):209-211.

[9]吕翠岩,张胜容,赵文景,等.中药复方糖痹康对糖尿病大鼠神经保护机制的研究[J].中华中医药学刊,2015,33(1):28-30.

[10]吕翠岩,张胜容,蔡朕,等.中药复方糖痹康对糖尿病大鼠坐骨神经NGF,BDNF及NT-3蛋白表达的影响[J].中华中医药杂志,2014,29(12):3946-3949.

[11]吕翠岩,张胜容,赵文景,等.中药复方糖痹康对糖尿病大鼠坐骨神经BDNF蛋白及BDNFmRNA表达的影响[J].中国中医基础医学杂志,2015,21(2):168-171.

[12]吕翠岩,李秋明,毛颖秋,等.糖痹康对糖尿病大鼠坐骨神经NGF蛋白及NGF mRNA表达的影响[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(5):157-161.

[13]吕翠岩,李秋明,毛颖秋,等.糖痹康对糖尿病周围神经病变大鼠血浆β-内啡肽的影响[J].中国中医药信息杂志,2014,21(4):49-51,52.

[14]吕翠岩,张胜容,赵文景,等.糖痹康对糖尿病周围神经病变大鼠VEGF表达的影响[J].中华中医药杂志,2016,33(1):219-221.

[15]吕翠岩.糖痹康干预糖尿病周围神经病变临床及作用机制研究[D].北京:北京中医药大学,2014.

[16]魏颖,时晓娟,王东超,等.糖耐康颗粒含量测定方法研究[J].世界科学技术-中医药现代化,2015,17(6):1169-1175.

Simultaneous determination of 6 main active components in Tang-Bikang by HPLC-DAD

WEI Ying1,2,3,WANG Dongchao1,2,3,GAO Jiaqi1,2,3,QIN Lingling2,3,SUN Wen2,3,ZHANG Yan2,3,SHI Haoxia1,2,3,LAN Wei4,XU Tunhai1,2,3*,LIU Tonghua2,3

(1.College of Pharmacy Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;2.Health Cultivation Laboratory of the Ministry of Education,Beijing 100029,China;3.Health Cultivation Laboratory of Beijing,Beijing 100029,China;4.Traditional Chinese Medicine College of Xinjiang Medical University,Urumqi 830011,China)

Objective To study a method for simultaneous determination of 6 active components in Tang-Bikang granules.Methods Determination of 6 active ingredients of Tang-Bikang granules by HPLC-DAD method,C18column (150 mm,4.6 mm,5 m),0.1% formic acid and water-0.1% formic acid and acetonitrile (18%-60%) gradient elution;The detection wavelength is multi wavelength detection,they are:196,201,202,204,276,228 nm;Standard curve method was used.Results The 6 active ingredients in 5 μg·mL-600μg·mL shows a good linearity,and the regression equations respectively are:Peoniflorin:Y=227 988X+182,R2=0.999 1；Campanulin:Y=417 929X-213,R2=0.999 7;Specnuezhenide:Y=199 569X-312,R2=0.998 3;Rosmarinci acid:Y=364 936X+152,R2=0.998 1;Baicalin:Y=64 131X+362,R2=0.999 4;Berberine:Y=87 882X+111,R2=0.999 5.The recoveries of the 6 active components are:Peoniflorin:101.44%(RSD 0.48%);Campanulin:99.99%(RSD 0.43%);Specnuezhenide:102.07%(RSD 0.57%);Rosmarinci acid:98.38% (RSD 0.46%);Baicalin:102.71% (RSD 0.485);Berberine:99.54% (RSD 0.77%).Conclusion The establishment of the content determination method is simple,fast and reliable,and it can be used to control the quality of Tang-Bikang particles.

Tang-Bikang;ingredients;HPLC-DAD;content determination

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.06.012

国家重大新药创制 “治疗糖尿病周围神经病变候选药物糖痹康临床前研究”(1000071320025)；2014年北京市教委共建成果转化与产业项目“糖调节受损中药保健食品产业化与社区干预疗效安全性评价研究”。

魏 颖(1991-)，女，博士研究生，主要从事中药降糖活性物质基础研究。

R284.2

A

2095-6258(2016)06-1135-04

2016-04-12)

*通信作者：徐暾海，男，博士，教授，博士研究生导师,电话-15300175337,电子信箱-Thxu@163.com