基于鳃的microRNA转录组研究中国蛤蜊对重金属镉的响应

张晶晶 ，李宏俊 ，秦艳杰，刘敏 ，叶晟

(1. 国家海洋环境监测中心 海洋生态室，辽宁 大连 116023；2. 大连海洋大学 水产与生命学院，辽宁 大连 116023)



基于鳃的microRNA转录组研究中国蛤蜊对重金属镉的响应

张晶晶1,2，李宏俊1*，秦艳杰2，刘敏1,2，叶晟1,2

(1. 国家海洋环境监测中心 海洋生态室，辽宁 大连 116023；2. 大连海洋大学 水产与生命学院，辽宁 大连 116023)

中国蛤蜊(Mactrachinensis)是一种重要的经济贝类，分布于我国的辽宁和山东。近年来，生境恶化和过度捕捞导致我国蛤蜊资源量减少。我们利用Illumina Hiseq-2500 平台对中国蛤蜊鳃的microRNA转录组进行测序，运用差异表达寻找对镉刺激有响应的功能microRNA。结果显示对照组获得了14 415 256条clean reads，实验组获得了15 570 111条clean reads。在这些reads中一共存在14 584 077小RNA，包括1 898 035条unique小RNA，其中对照组和实验组共有187 859条unique小RNA。两个组的小RNA文库的片段长度分布是相似的，大部分小RNA长度分布在26～27 nt。在对照组文库中最丰富的片段长度是27 nt，其次是28 nt、26 nt和23 nt。在实验组文库中，数量最丰富的片段长度是26 nt，其次是27 nt、28 nt和23 nt。经过对序列前体以及结构特征的分析，发现这两个组中一共有50个microRNA，其中已知的是38个，新发现的是12个。对照组和实验组microRNA含量最丰富的片段长度是23 nt。通过差异表达分析，5个microRNA基因具有显著性差异且从对照组到实验组的表达量是上调的，其余45个没有显著性的差异。把这50个序列与中国蛤蜊转录组进行比对，一共找到了542个靶基因。5个具有表达差异的基因一共比对到11个靶基因。把这11个靶基因与NCBI数据库比对，4个靶基因在COG中得到注释，1个靶基因在GO中得到注释，6个靶基因在KEGG中得到注释，11个靶基因在nr数据库中得到注释，注释到的基因有泛素蛋白连接酶E3，Wnt信号通路，G蛋白信号调控等。

中国蛤蜊；镉；microRNA；差异表达；功能基因

1 引言

中国蛤蜊(Mactrachinensis)，又名飞蛤，属软体动物门，瓣鳃纲，帘蛤目，蛤蜊科，蛤蜊属，生活在潮间带中沙区的细砂滩，至水深60 m的浅海区，在我国分布于辽宁、山东，在日本、朝鲜也有分布[1]。中国蛤蜊肉味鲜美，出肉率高，是中国重要的经济贝类。由于缺乏苗种，中国蛤蜊的滩涂养殖尚处于自然繁衍、保护资源的状态[2]。近几年来，海水的污染以及过度捕捞使中国蛤蜊野生资源缺乏，种质资源退化。

镉(Cadmium)是一种具有金属光泽的非典型过渡型重金属，是一种非必须元素。它是一种生物蓄积性强、具有“三致”作用、毒性持久的剧毒元素，摄入过量的镉对生物体的危害极其严重，会导致肾脏、肺部、肝脏、骨骼、生殖器官的损伤，对免疫系统、心血管系统等具有毒性效应，进而引发多种疾病。已有研究证明镉对野生生物来说是一个高毒性的物质，并且能使人致畸致癌[3]。工业发展带来了经济的腾飞，但同时工业发展的废弃物，如未经处理的或者处理不达标的包含有重金属，有机化合物等的废水等毁坏了中国东部海域的水质[4-5]。中国生态标准(2001—2005)记载黄、渤海镉污染严重，2013年海洋环境质量公报报道辽东湾主要超标要素之一是镉。双壳贝类习固着型的滤食生活且自身的用于代谢的混合氧化系统存在缺陷，导致体内很容易富集环境中存在的重金属离子[6-9]。贝类体内富集的镉含量与环境中镉离子的浓度呈正相关[10-11,13]。张传永和孙振兴[14]等通过镉对中国蛤蜊的急性试验研究表明镉对中国蛤蜊的24 h、48 h、72 h、96 h的半致死浓度(LC50)分别为12.48 mg/L、7.06 mg/L、5.52 mg/L、4.22 mg/L；Cd2+对中国蛤蜊的安全质量浓度为0.04 mg/L。Cd2+对中国蛤蜊的急性毒性作用较强；在Cd2+的慢性毒性胁迫下，中国蛤蜊的鳃和消化盲囊的SOD活性受到了抑制。

MicroRNA又称miRNA，是一类长度约为19～25 nt的内源性非编码单链小分子RNA，属于小RNA的一种，广泛存在与真核生物中，主要以单拷贝、多拷贝或基因簇的形式存在，具有高度保守性、时序性和组织特异性[15-16]。MiRNA的生成始于核内，通过Micro-processor复合体(Drosha和DGCR8)剪切后生成单链RNA前体。然后在Exportin5-Ran-GTP蛋白出核转运体的辅助下转至胞质。在胞质中由Dicer酶剪切加工形成长度在19～25 nt的成熟的miRNA。起初，成熟的miRNA与其互补的序列结合成双螺旋结构，随后双螺旋结构解旋，其中一条结合到RNA诱导的基因沉默复合物(RNA-induces Silencing Complex，RISC)上，该复合物以不完全配对的方式结合到靶mRNA的3`非编码区(UTR)上，从而导致该基因被诱导或者抑制，甚至沉默。近年来也有研究发现，miRNA还可以与mRNA的5’UTR和氨基酸编码区(Coding Sequences，CDS)结合[17]。1993年，Lee等[18]在对秀丽新小杆线虫(Caenorhabditiselegan)进行突变体的遗传分析时，发现了一种可时序调控胚胎后期发育且长度约为22 nt的小分子非编码RNA——lin-4，但是这个发现在当时并没有引起人们的关注；直至2000年，Reinhart[19]等又在线虫(C.Elegan)中发现了let-7，miRNA才被科学界广泛关注，let-7成为第二个被发现的miRNA基因。在过去的几十年间，从不同的物种中鉴定出了大量的miRNA。据尹福强[20]介绍，从2002至2012年，miRNA的数量由215个增至25 141个，仅2011—2012年，测出miRNA的物种新增加了40个，说明miRNA已经受到人们的关注，成为热门研究领域。

miRNA通常在转录后水平负调控其靶基因的表达，在机体生命活动的各个过程，比如细胞增殖和分化，凋亡疾病的发生发展等中，发挥着重要的调节作用[15]。尽管软体动物作为海鲜在农业中有着它们重要的价值，但对它们的miRNA的研究并没有如植物、昆虫和重要动物寄生虫的间接宿主研究的多[21]。在软体动物中，长牡蛎(Crassostreagigas)[22]、泥蚶(Tegillarcagranosa)[23]和马氏珠母贝(Pinctadamartensii)[24]等已经得到了miRNA的转录组并且得出一些与免疫反应或者抗性有关的miRNAs，以及得出miRNA可能启动与之相关的反应，比如吞噬、凋亡、氧化还原反应，让生物更好的适应环境和生存的结论。本文通过镉离子刺激中国蛤蜊的急性毒性试验以及运用Illumina Hiseq2500 SE50测中国蛤蜊鳃的miRNA转录组，期望通过对照组和实验组的差异性表达分析，找到响应镉离子刺激的miRNA，并且希望为寻找中国蛤蜊响应镉离子刺激的抗性机制提供数据。

2 材料与方法

2.1 材料

2014年6月，于大连长兴市场购买成熟的大小一致的中国蛤蜊，放置到4×100 L的水箱中暂养。7 d之后，对中国蛤蜊进行Cd2+急性毒性试验，投毒试剂是CdCl2。100只中国蛤蜊平均分到2个水箱中，每个水箱代表一个处理，分别是空白对照组和实验组，其浓度分别是0和2.76(1/2 LC50)mg/L。在养殖期间，每天投喂螺旋藻一次，换水两次，温度和盐度分别控制在(20±1)℃和30。经过48 h处理，分别解剖对照组和实验组的3只中国蛤蜊，获得鳃并组内混合，分别命名为S01和S02，浸泡在RNA-EZ Reagents D RNA-Be-Locker A(购于上海生工)，4℃过夜后，放于-80℃储存，然后送北京百迈克测miRNA转录组。

2.2 小RNA文库的构建，库检和深度测序

用Trizol试剂提取总的RNA，随后用琼脂糖电泳和NanoDrop测试检测RNA的纯度，Qubit2.0检测RNA的浓度，Agilent 2100 Bioanalyzer 检测RNA的数量。运用NEB Multiple Small RNA Library Pre Set Kit for Illumina 试剂盒构建小RNA文库，质量比较高的总RNA被用作构建小RNA的原始材料。根据小RNA的序列末端的特征，其3’端被连接上与之配对的适用于Illumina测序的接头，然后反转录得到第一条链；之后在序列的5’端加上另一个合适的接头，以第一条链为模板反转录，完成了cDNA的合成。接下来用和接头互补的引物，进行PCR扩增，获得PCR产物；把产物通过6%的聚丙烯酰胺凝胶，分离目标基因，切胶，然后用Plastic回收试剂盒纯化回收得到小RNA文库。得到小RNA文库之后，首先运用Qubit 2.0简单的计算小RNA文库的浓度，当浓度达到2 ng/μL，说明用Agilent 2100检测得到的文库中的插入序列的大小的结果是正确的。这时，为了确保文库的质量，运用ECO实时荧光定量PCR精确的计算文库中基因的数量(有效的文库浓度大于2 nmol/L)。如果质量达标，就运用Illumina Hiseq2500 SE50对小RNA文库进行测序。

2.3 测序数据的生物信息学分析

运用Illumina Hiseq2500 SE50测序之后需要对得到的小片段进行加工。首先是过滤掉低质量的片段、接头序列、片段长度大于30 bp和小于18 bp的序列，以及序列片段中含有N的序列。这些clean片段与Rfam和GenBank数据库比对，得到了ncRNA、rRNA、tRNA、snRNA、scRNA和snoRNA的注释信息；与现有的中国蛤蜊基因组文库进行比对获得与miRNA有联系的基因组序列。运用miRDeep 2，依据miRNA的生物学的特性并且结合其环状结构的特征及预测，在获得的基因组序列中鉴定总miRNA及其保守和新的miRNA。运用RNAhybrid[25]和miRanda[26]预测miRNA的靶基因。

2.4 MiRNA的差异表达分析和预测的靶基因的注释

为了得出S01和S02的差异表达数据，DESeq[27]被用于筛选具有差异表达量的miRNA序列，筛选的条件是同时满足假阳性率(FDR)小于0.01和fold change≥2，并且用Benjamini Hochber矫正过的P值校正FDR。Hierarchical cluster analysis被用于估算协同表达的趋势和样品之间miRNA的不同表达量。被预测到目的基因与NCBI常用数据库比对得到注释信息。

3 结果

3.1 小RNA的测序

运用Illumina Hiseq-2500 SE50平台，一共得到34 590 000条原始reads，登录号SRP075745，经过过滤得到29 990 000条clean reads，其中S01和S02分别得到14 415 256和15 570 111条clean reads(表1)。把中国蛤蜊的鳃的S01和S02的clean reads与中国蛤蜊mRNA转录组，Rfam和GenBank数据库比对之后，分别发现了1 124 747和623 018条genome，594 070和377 193条rRNA，322和266条snRNA，27和58条snoRNA，5 682和6 408条tRNA，3 457和2 520条重复序列，其他的分别是S01和S02的获得的小RNA的88.01%和93.52%(表2)。rRNA在S01和S02文库中clean reads的百分比分别是4.12%和2.42%，说明这两个文库的质量是可靠的。经过拼接和比对，这两个文库一共得到14 584 077条小RNA，S01和S02共同拥有12 584 077条，S01特有1 306 643条，S02拥有772 379条(图1)。聚类小RNA(Uniq小RNA)一共1 898 035条，S01和S02共同拥有187 859条，S01特有1 039 738条，S02特有670 438条(图2)。这两个文库的小RNA的片段长度大部分分布在26～27 nt(表3)，说明这两个文库的片段的长度分布是相似的。在S01文库中最丰富的片段大小是在27 nt(173 373 条)，其次是28 nt(137 879条)，26 nt(135 169条)和23 nt(109 334条)。在S02文库中，数量最丰富的片段长度是26 nt(93 571条)，其次是27 nt(135 169条)，28 nt(73 418条)和23 nt(73 099条)。经过与中国蛤蜊转录组文库比对，S01文库中产生1 124 747 clean 片段，S02文库中产生623 018 clean片段。这两个文库的疑似miRNA片段长度分布在18～25 nt之间，S01和S02含量最丰富的片段是23 nt，分别是96 043条和64 491条，其次是22 nt(1 771和1 773条)和21 nt(1 133条和1 279条)。

表1 中国蛤蜊小RNA数据统计

图1 中国蛤蜊总的小RNA的韦恩分布图Fig.1 Wayne figure of total small RNA distribution of the Chinese surf clam

图2 中国蛤蜊独特的小RNA的维恩分布图Fig.2 Wayne figure of unique small RNA distribution of the Chinese surf clam

类型S01数量百分比S02数量百分比genome11247477.80%6230184.00%rRNA5940704.12%3771932.42%scRNA00.00%00.00%snRNA3220.00%2660.00%snoRNA270.00%580.00%tRNA56820.04%64080.04%repbase34570.02%25200.02%other1268695188.01%1456064893.52%Cleanreads14415256100%15570111100.00%

2.2 miRNA及其靶基因的确认

一共预测出了50个miRNA，包括38条保守的和12条新的miRNA。其中25条miRNA的长度是22 nt，14条miRNA的长度是21 nt，8条miRNA的长度是23 nt。这些新的miRNA被预测了前体结构，并且用miRDeep软件进行估计前体的分值，图3是一个新发现的miRNA预测的前体结构。在38条保守的序列中，其中的37条比对到了478条靶基因，12条新预测到的miRNA序列比对到了129条靶基因(表4)。

表3 疑似miRNA 长度统计表

图3 新发现的miRNA预测的前体结构Fig.3 The predicted precursor structure of one novel miRNA

类型miRNA数有比对结果的miRNA靶基因保守miRNA3837478新预测的miRNA1212129总计5049542

2.3 miRNA的差异表达

运用EcoTM实时荧光定量PCR估计miRNA的表达量，在这50个miRNA中有5个差异表达基因，包括3个保守的miRNA基因(sme-miR-2202-5p，dme-miR-963-3p和 mmu-miR-216c-3p)和2个新的基因，并且这些基因的表达量是升高的(表5)。其余的45个基因中，17个表达趋势是降低的，28个表达趋势是升高的，但不符合FDR<0.01且fold change≥2(P<0)条件，即差异显著性不明显。图4是筛选出的5个差异表达miRNA表达量的柱状图，从图中可以看出S01的表达量高于S02的表达量。图5是这两个文库表达水平的分析和展示，S02的log10rpkm的值高于S01，这也说明这5个基因在S02的表达量要高于S01的表达量。

表5 5个显著性差异的miRNA的靶基因的注释

续表5

图4 5个差异表达miRNA的柱状图Fig. 4 Expression profiles of the 5 differential expression miRNA

图5 5个差异表达的基因在两个文库miRNA表达水平的分析与展示Fig.5 The analysis and show of the expression level of the 5 differential expression in two miRNA library

2.4 靶基因的注释

使用BLAST软件将预测得到的542个靶基因序列与NR、GO、COG、KEGG数据库比对，获得靶基因序列的注释信息。最终获得注释信息的靶基因有91个。MiRNA靶基因注释的统计结果见表6，在COG中注释24条，GO中注释23条，KEGG注释34条，得到注释的基因的长度在1 000 bp之上的有61条，这个数值是片段300～1 000 bp被注释数量的2倍。其中具有显著表达差异的基因的注释统计结果如表6，在COG数据库中比对到的靶基因数是4条，GO中1条，KEGG 5条，在nr数据库比对到的一共是11条。

表6 所有miRNA靶基因注释统计表

表7 注释的差异miRNA靶基因数量统计

2.4.1 差异表达miRNA靶基因的GO分类

GO数据库适用于各个物种，能对基因、蛋白质进行限定和描述。GO分析按照细胞组分、分子功能、生理过程对基因进行分类，从而展示出具有差异表达的与生物学功能显著相关的miRNA靶基因。样品S01与S02间差异表达miRNA靶基因GO分类统计结果见图6。两种不同的颜色代表所有靶基因以及差异表达靶基因的GO分类统计。差异表达miRNA分子功能中的catalytic activity、binding和生理过程的代谢过程，细胞过程，刺激响应以及信号的靶基因的富集趋势比所有靶基因的高，尤其是刺激响应和信号转导增高的趋势更显著，说明这些靶基因参与中国蛤蜊对镉离子的刺激响应的过程。

2.4.2 差异表达miRNA靶基因的COG注释

COG数据库是基于细菌、藻类、真核生物的系统进化关系构建得到的，利用COG数据库可以对基因产物进行直系同源分类。样品S01与S02间差异表达miRNA靶基因COG分类统计结果见图7。其中E、J、K、L、O、R、T对应的功能基因表现出差异表达，分别代表的是氨基酸的转运和代谢，翻译、核糖体结构和生物转化，转录本，复制、重组和修复，后转录修复，蛋白质折叠和分子伴侣，通用功能预测和信号转导代谢。

图6 5个差异miRNA靶基因GO注释聚类图Fig.6 The GO annotation cluster of 5 differential expression

图7 5个差异miRNA靶基因COG注释分类图Fig.7 COG annotation of the target genes of 5 differential expression

2.4.3 差异miRNA靶基因的KEGG注释

在生物体内，通过不同基因相互协调来行使生物学功能。基于Pathway分析有助于进一步解读基因的功能。KEGG是有关Pathway的主要公共数据库。把5个具有显著差异的miRNA的靶基因与KEGG数据库进行比对，最后的数据总结如表8。在KEGG通路中一共比对到5条通路，分别是Lysosome，Wnt signaling pathway，Ribosome biogenesis in eukaryotes，Ribosome，Ubiquitin mediated proteolysis。

表8 5个差异性表达miRNA的靶基因的KEGG注释

3 讨论

MiRNA是一大类小的非编码的RNA，它们通过使目标基因信使RNA的降解，抑制翻译的方式阻止基因的表达。众所周知，miRNA可以调节很多生理和病理的过程，比如宿主免疫反应和应激反应[28-29]。在本研究中，中国蛤蜊两个处理组，经Illumina Hiseq2500平台测序，一共得到了34.59 M原始reads。经过去掉低质量的序列，接头和长度小于18 nt和大于30 nt的序列，获得了29.99 M高质量的序列。去掉rRNA、scRNA、snRNA、snoRNA、tRNA等，得到疑似是miRNA的序列173 583条，其中S01有102 228，S02有71 355条，最后一共预测得到了50个miRNA。最丰富的miRNA序列的长度是22 nt(25条)，其次是21 nt(14条)，23 nt(8条)，24 nt(2条)和20 nt(1条)。这些结果和海参(Apostichopusjaponicus)[30]、 长牡蛎(C.gigas)[22]、泥蚶(T.granosa)[23]和马氏珠母贝(P.martensii)[24]基本一致。其他的研究认为同一大类物种中的最主要的miRNA的长度是一样的，比如昆虫Blattellagermanica[31]、Locustamigratoria[32]和Aedesalbopictus[33]的最优势片段的大小是22 nt，植物Citrustrifoliate[34]、Cucumissativus[35]和Vitisvinifera[36]的最优势的片段是24 nt。但是在贝类中，马氏珠母贝(P.martensii)[24]的最优势的片段长度是22 nt，泥蚶(T.granosa)[23]的是21nt，长牡蛎(C.gigas)[22]的是22 nt。

50个miRNA中38条可以注释的序列称为已知的miRNA，12条不能得到注释称为新的miRNA。中国蛤蜊鳃中的miRNA的数量与目前已得到miRNA的贝类相比较是最少的，长牡蛎(C.gigas)[22]血细胞中含有199条miRNA，包括71条已知的和128条新的；马氏珠母贝(P.martensii)[24]中含有258条miRNA，包括205条已知的和53条新的；泥蚶(T.granosa)[23]血细胞中含有254条miRNA，包括215条已知的和39条新的，这些差异除了与物种本身所含有的miRNA有关之外，可能也与小RNA不同的测序深度有关。这12条新的基因可能是中国蛤蜊独有的，因为在其他报道中并没有与这些基因相同的序列。在所有的miRNA中，cel-miR-34-5p，sme-miR-2202-5p，sma-miR-8478-5p，mmu-miR-216c-3p是对照组和实验组中排名前5的最丰富的基因，它们的高的表达量暗示他们在维持鳃的生理功能方面起到重要的作用[37]。但是，由NCBI小RNA数据库得出miR-2202-5p仅存在于涡虫中，cel-miR-34-5p存在于13种物种中，miR-8478-5p仅存在于曼氏裂体吸虫中，miR-216c-3p仅存在于小鼠中。有趣的是，中国蛤蜊的miRNA基因有6个miRNA至少有一个前体，暗示它们可以从不同的位点进行转化并且有很多的启动子，这就赋予他们在多样条件下的转录水平中有更多的调控机制，并且有更多的机会参与生理学功能的调节[38]。

MiRNAs调控已经被认为在脊椎动物的免疫和适应阶段是一个重要的调控原则[39]。为了检测miRNA在中国蛤蜊免疫反应中的潜在的作用，经过镉离子刺激之后，估算了鳃中经过镉离子极性毒理刺激之后的miRNA的表达水平。在50个miRNA中有18个表达水平是降低的，32个是升高的。其中有5个miRNA具有显著差异，并且都是上调的，说明这5个miRNA在中国蛤蜊抵御镉离子反应的过程中起到作用，猜测他们可能在免疫反应中起到重要的调控的作用[40- 41]。

为了描述miRNA和靶基因在镉离子刺激下的作用网络图以及获得差异表达miRNA的更深刻的生物学意义，我们把与其对应的靶基因与GO、KEGG、COG、nr数据库进行比对，分析它们潜在的功能。50个miRNA在COG数据库中比对到了7条具有显著性差异的基因功能束。说明在镉离子刺激下，中国蛤蜊的这些结构和功能基因发生响应。这7条基因功能束分别代表氨基酸的转运和代谢，翻译、核糖体结构和生物转化，转录本，复制、重组和修复，后转录修饰，蛋白质折叠和分子伴侣，通用功能预测和信号转导代谢。1个miRNA对应的基因在GO数据库中得到了注释，注释为分子功能：protein serine/threonine kinase activity(GO:0004674)和ATP binding(GO:0005524)以及生理过程：protein phosphorylation(GO:0006468)和Wnt signaling pathway(GO:0016055)，这个基因在nr数据库中对应的是hypothetical protein CAPTEDRAFT_162678基因，可以猜测这个基因在GO注释的这些功能中都起到了作用。Wnt信号通路是参与胚胎及器官发育的主要4大类信号传导途径之一，对胚胎及器官发育起着不可替代的作用，此外还参与一些疾病，比如肿瘤，心血管疾病和肝纤维化的调控[42]。丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，是由催化亚基C、结构亚基A和多种调控B亚基组成的复合物。蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A, PP2A)是真核生物中最主要的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶。PP2A在细胞信号转导通路包括DNA损伤修复、细胞周期进程、转录激活、细胞转化、细胞凋亡等过程中起着很重要的作用。研究发现PP2A活性下降导致细胞对重金属的毒性敏感性增强，并证实PP2A通过介导AMP-激活蛋白激酶α(AMPKα)的去磷酸化来调控热休克蛋白(heat shock proteins，HSP)中HSP70和HSP27的表达并参与细胞应激反应。通过荧光定量发现，hypothetical protein CAPTEDRAFT_162678表达量是增加的，说明这个基因在抵御镉离子的刺激中起到重要的作用。这个基因所在的这些通路的相互作用形成中国蛤蜊抵御镉离子刺激的调控网络图。

5个基因注释到KEGG，包括泛素和溶酶体等。泛素-蛋白酶体途径(Ubiquitin—proteasome pathway)和溶酶体途径是真核细胞内的蛋白质主要的蛋白酶解降解系统。通常情况下，细胞内膜相关蛋白和某些在应激状态下产生的蛋白质以及通过内吞过程从胞外摄取的蛋白质等主要经溶酶体降解；而泛素—蛋白酶体途径则高选择性地降解细胞在应激和非应激条件下产生的异常蛋白质，对维持细胞正常生理功能具有十分重要的意义。

泛素是一个由76个氨基酸残基组成的高度保守的多肽，因其广泛分布于各类细胞中而得名，被泛素标记的蛋白质将被特异性地识别并被迅速降解．细胞中蛋白质的降解是一个复杂的、被严密调控的过程，此过程在涉及细胞基本进程(如DNA修复，细胞周期调控，细胞凋亡等)，抗原呈递，炎症反应等一系列通路中扮演重要角色[43]．泛素连接酶E3是泛素化过程中的关键酶之一，介导活化的泛素从结合酶E2转移到底物，不同的泛素连接酶作用于不同的底物蛋白，决定了泛素化修饰的特异性。

在nr数据库中比对到了G蛋白信号调控蛋白(RGS)，RGS负责蛋白质的快速避开G protein-coupled受体信号通路的主要机制。RGS蛋白通过GTPase蛋白激活RGS区域对G蛋白进行负调控。分子伴侣是在生物大分子的折叠、组装、转运及降解等过程中起协助作用，参与协助抗原的呈递和遗传物质的复制、转录及构象的确立，但自身并不发生任何变化的一大类广泛存在于生物体内的蛋白质分子。总之，这5个具有显著差异的基因在中国蛤蜊抵御镉离子刺激的作用下都能起到重要的作用。

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Identification and differential expression of gill microRNA in the Chinese surf clam (Mactra chinensis) with Cd2+exposure

Zhang Jingjing1,2, Li Hongjun1, Qin Yanjie2, Liu Min1,2, Ye Sheng1,2

(1.MarineEcologyDepartment,NationalMarineEnvironmentalMonitoringCenter,Dalian116023,China; 2.CollegeofFisheriesandLifeScience,DalianOceanUniversity,Dalian116023,China)

The Chinese surf clam (Mactrachinensis) is an economically important clam, distributed in Liaoning Province and Shandong Province. In recently years, because of coastal environmental deterioration and overfishing, the natural population ofM.chinensishave considerably declined. In this paper, we studied the microRNA transcriptome of gills, and control and experimental group were sequenced through Illumina Hiseq 2500 CE. The differential expression andlysis was used to find the functional microRNA response to the Cd2+exposure. Through Illumina Hi-seq 2500 CE, a total of 14 415 256 clean reads and 15 570 111 clean reads were yielded in the gill of control and experimental group respectively. A total of 14 584 077 small RNA, including 187 859 unique small RNA were yielded. The distribution of the small RNA length in the two library was similar, most of them were 26-27 nt. 27 nt was the most abundant length in control group, followded by 28 nt, 26 nt, and 23 nt; 26 nt was the most abundant length in experimental group, and followed by 27 nt, 28 nt and 23 nt. 50 microRNA was found in unique small RNA, including 38 conserved and 12 novel genes. The most abundant length of microRNA in the two library was the same, 23 nt. Through the analyze of differential expression analysis, the expression of 5 microRNA was induced with significantly difference, other 45 microRNA was regulated up or down without significantly difference. 542 target genes were yielded when the 50 microRNA were hit to mRNA genome. And the target genes of differential expression microRNA were annotated by hitting to the NCBI database, and 4 genes hit to the COG, 1 genes hit to the GO, 5 genes hit to the KEGG and 11 genes hit to the nr database. The genes hit to the NCBI database included E3 ubiquitin-protein ligase, Wnt signaling pathway and Regulator of G-protein signaling 22.

Mactrachinensis; cadmium ion; microRNA; differential expression; functional genes

2016-06-30；

2016-09-15。

国家自然科学基金(31572595)；国家海洋局近岸海域生态环境重点实验室开放基金(201511)。

张晶晶(1989— )，女，河南省周口市人，研究方向为分子生态学。E-mail：liutian.3090@163.com

*通信作者：李宏俊，博士，副研究员，研究方向为分子生态学。E-mail：hjli@nmemc.org.cn

10.3969/j.issn.0253-4193.2016.12.012

S917.4

A

0253-4193(2016)12-0118-14

张晶晶，李宏俊，秦艳杰，等. 基于鳃的microRNA转录组研究中国蛤蜊对重金属镉的响应[J].海洋学报，2016，38(12)：118—131,

Zhang Jingjing, Li Hongjun, Qin Yanjie, et al. Identification and differential expression of gill microRNA in the Chinese surf clam (Mactrachinensis) with Cd2+exposure[J]. Haiyang Xuebao，2016，38(12)：118—131, doi:10.3969/j.issn.0253-4193.2016.12.012