诃子炮制前后多糖的含量变化研究*

温聪聪，梁世凯，曹美娇，王 巍

(辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600)



诃子炮制前后多糖的含量变化研究*

温聪聪，梁世凯，曹美娇，王 巍

(辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600)

采用苯酚-硫酸法测定了诃子炮制前后多糖的含量变化情况，为研究诃子“煨熟固肠止泻”的炮制原理提供理论依据。方法学考察结果显示葡萄糖质量浓度在4.028～16.11 μg/ mL浓度与吸光度具有良好的线性关系；平均回收率为97.3%，RSD=1.3%(n=6)。使用该方法测得的不同产地诃子药材生品中多糖含量在4.35%～10.64%，制品中多糖含量在5.17%～10.79%。结果表明炮制后诃子中多糖含量略有增高。

诃子；炮制；多糖；苯酚-硫酸法

诃子为使君子科植物诃子TerminaliachebulaRetz.及绒毛诃子TerminaliachebulaRetz. var. tomentella Kurt.的干燥成熟果实，收载于《中国药典》2015年版一部[1]。在传统中医应用中，诃子存在生熟异用现象，《本经逢原》中就有“诃子苦涩降敛，生用清金止嗽，煨熟固肠止泻”的记载[2]。现代临床上诃子多为制后使用，治疗久泻、痢疾、肠风泻血等[3]，即中医的“肠澼”，与现代医学的溃疡性结肠炎(UC)相对应[4]。药理学研究表明多糖类成分可以通过调节结肠黏膜细胞因子的表达，减轻肠道局部免疫反应，对UC起到治疗作用[5-8]。本文拟建立诃子多糖的含量测定方法，并检测炮制前后多糖含量的变化，为合理解释诃子“煨熟固肠止泻”的炮制原理提供理论依据，并为进一步炮制工艺的优化奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪 器

ETTLER AE240型十万分析天平，瑞士METTLER，ALC-110.4型分析天平，德国艾科勒公司；HH-4型恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司，UV-3010型紫外分光光度计，日本日立公司。

1.2 试剂与试药

诃子购自药材市场，经辽宁中医药大学鉴定教研室翟延君教授鉴定，均为使君子科植物诃子TerminaliachebulaRetz.。D-无水葡萄糖对照品购自中国药品生物制品检定所(批号：110833-201503，供含量测定用)，乙醇、石油醚、氯仿、正丁醇、苯酚、浓硫酸均为分析纯，购自天津科密欧化学试剂有限公司，水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 诃子多糖的提取与精制

取药材(S5)适量，砸碎，取果肉，粉碎，过40目筛，称取样品粉末10 g，置于圆底烧瓶中，加入石油醚(60～90 ℃)100 mL，回流提取2次，每次30 min，倾出石油醚液，药渣挥干石油醚后加入蒸馏水100 mL，回流提取2次，每次2 h，合并提取液，减压浓缩，浓缩液中加入95%乙醇调含醇量至85%，抽滤，滤渣真空干燥后即得粗多糖。粗多糖加蒸馏水复溶后经过Sevag试剂(氯仿:正丁醇 5:1)除蛋白，脱蛋白后的多糖溶液中加入乙醇调含醇量为85%，沉淀用乙醇反复洗涤，干燥，得精制多糖干燥物。

2.2 供试品制备及试剂配制

2.2.1 对照品溶液制备

取105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖约10 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加适量水溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得0.1007 mg/mL的葡萄糖对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备

取诃子药材适量，砸碎，取果肉粉碎，过40目筛，取粉末0.1 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，加入40 mL 80%乙醇，加热回流1 h，抽滤，用少量热80%乙醇洗涤2次。滤渣在常温下挥干，将滤渣连同滤纸置烧瓶中，加蒸馏水40 mL，加热回流1 h，趁热滤过，用少量热水洗涤滤器，合并滤液与洗液，放冷，移入50 mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 苯酚液的制备

取苯酚100 g，加铝片0.1 g，碳酸氢钠0.05 g，蒸馏。收集182 ℃摄氏度馏分5 g，置100 mL量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀后，滤过至棕色试剂瓶中，得5%苯酚液，置冰箱中储存备用。

2.3 样品测定方法

精密吸取供试品溶液2 mL，置于10 mL刻度试管中，精密加入5%苯酚液1.0 mL，摇匀，再加入浓硫酸6 mL，摇匀，放置5 min，再置沸水浴中保温5 min，取出冷却至室温，加水至10 mL，于486 nm处测定吸光度。

2.4.1 标准曲线制备

精密吸取葡萄糖对照品溶液0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL，分别置于10 mL刻度试管中，分别加水至2 mL，再按2.3项下方法操作，于486 nm处测定吸光度值，以葡萄糖浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。得回归方程：A=45.804C-0.0054，r=0.9992，表明样品在0.004028～0.016112 mg/mL与吸光度线性关系良好。2.4.2 换算因子测定

取2.1项下所制得的诃子精制多糖20 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.2005 mg/mL的诃子粗多糖溶液。取该溶液2.0 mL，按2.3项下方法测定吸光度，重复5次。由回归方程求出诃子精制多糖溶液中葡萄糖浓度，并计算其中葡萄糖的含量，按下式计算换算因子：

f=W/(C×D)

式中：W——诃子精制多糖的质量，mgC——诃子精制多糖溶液中葡萄糖浓度，mg/mLD——诃子多糖的稀释因数

根据吸光度的5次测定值求得f为3.333。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度考察

精密吸取精制多糖溶液2 mL，按2.3项下方法显色，连续测定6次，分别记录吸光度值，计算RSD值为0.7%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 稳定性考察

(1)清万树《词律》中载《卜算子》调9体[注]柳永与张先的名为《卜算子》的词作，实则是《卜算子慢》，且柳永之作为《卜算子慢》正体。[1]118-121

精密吸取精制多糖溶液2 mL，按2.3项下方法显色，分别于反应后0、20、40、60、80、100、120 min时测定吸光度值，计算RSD值为1.2%，表明样品显色后2 h内颜色稳定，适宜测定。

2.5.3 重复性考察

取样品(S5)粉末6份，每份0.1 g，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.3项下方法测定吸光度，分别计算多糖含量并计算RSD值。结果样品中多糖平均含量为4.887%，RSD值为1.8%，表明方法重复性良好。

2.5.4 回收率考察

取已知准确含量(4.89%)的样品(S5)6份，每份0.05 g，精密称定，再加入葡萄糖对照品约2.4 mg，按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.3项下方法测定吸光度，计算回收率及RSD值。结果表明回收率均在95.0%～105.0%之间，RSD值亦符合相关规定。结果见表1。

表1 回收率考察结果

2.6 样品含量测定

取不同产地诃子生品及炮制品(将药材与麦麸以100:40投入锅中，控制温度为130～150 ℃，翻炒20 min)按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.3项下方法测定吸光度，根据回归方程求出供试品中葡萄糖的浓度，按下式计算出多糖含量，结果见表2。

多糖含量=(C×D×f/W)×100%。

式中：C——供试品溶液中葡萄糖的浓度，mg/mLD——样品溶液的稀释倍数f——换算因子W——样品质量，mg

表2 不同产地诃子多糖含量测定结果

3 讨论与结论

3.1 供试品溶液制备方法考察

试验中对供试品溶液制备方法进行了考察[9-10]，以S5样品为研究对象，首先比较了回流提取与超声提取的所得总多糖含量，回流提取为5.18%，超声提取为4.32%，证明回流提取的提取效率更高；然后对醇提后蒸馏水回流提取时间进行考察，比较了提取20 min、40 min、60 min、90 min所得多糖含量，分别为4.56%、4.88%、5.21%、5.23%，证明提取60 min时多糖已基本提取完全。经考察确定供试品制备方法为现用80%乙醇回流提取1 h后，在采用蒸馏水回流提取1 h。

3.2 样品测定方法考察

试验中先后对5%苯酚加入量、硫酸加入量、水浴温度、水浴时间进行考察[9-10]，结果表明在加入5%苯酚液1.0 mL、浓硫酸6 mL、沸水浴保温5 min的条件下吸光度值最高，测定最灵敏。以精制多糖为研究对象，按确定的方法进行显色，以蒸馏水作为空白，扫描200～800 nm的吸收光谱，结果在486 nm处为最大吸收，因此确定检测波长为486 nm。

诃子中化学成分以鞣质类为主，应是诃子治疗UC的主要有效成分，但中药的特点是多种成分发挥协同治疗作用，而且现代药理学研究表明多糖类成分却有治疗UC的作用，因此若研究诃子煨后治疗UC的有效物质，多糖类应是主要研究目标之一。

本文建立了诃子多糖的含量测定条件，对建立的方法进行方法学考察，各项指标均符合含量测定的要求，证明该方法可准确测定诃子中多糖的含量。用该方法对8个不同来源的诃子药材进行炮制前后多糖含量的比较，结果表明8个样品炮制后多糖含量均有不同程度的增高，考虑炮制后多糖含量的变化可能是其煨后固肠止泻作用增强的原因之一。

[1] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：173.

[2] 江苏新医学院. 中药大辞典(上册)[M]. 上海: 上海人民出版社, 1977: 1174-1176.

[3] 史欣德，石历闻. 从220首古方看诃子效用[J].中医研究, 1996, 9(4):41-44.

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[5] 郭振军. 大黄多糖治疗溃疡性结肠炎的机制研究[D]. 西安:第四军医大学, 2013.

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Study on Change of Content of Polysaccharides in Crude and ProcessedTerminaliachebulaRetz.*

WENCong-cong,LIANGShi-kai,CAOMei-jiao,WANGWei

(School of Pharmacy, Liaoning University of TCM, Liaoning Dalian 116600, China)

The change of the content of polysaccharides in crude and processedTerminaliachebulaRetz.was determined by phenol-sulfuric acid method, to explain the effect of strengthening the Astringent to the intestine and relieve diarrhea after bran-roasted. Methodology study results showed that glucose showed a good linear relationship in the range of 4.028～516.11 μg/mL (r=0.999 2,n=6) and the average recovery of glucose was 97.3%, RSD was 1.3% (n=6). The content of polysaccharides in the crude and processedTerminaliachebulaRetz. were 4.35%～10.64% and 5.17%～10.79%, respectively. The experimental results showed that the content of polysaccharide inTerminaliachebulaRetz. increased slightly after processing.

TerminaliachebulaRetz.; processing; polysaccharide; phenol-sulfuric acid method

辽宁省博士启动基金(NO. 201501097)。

温聪聪(1994-)，男，硕士研究生，从事中药分析及新药开发研究。

R284.1

A

1001-9677(2016)023-0057-03