罗氏公司Cobas E602电化学发光分析仪检测抗缪勒管激素的方法学评价

曾 玉，吴 畏，姚 辉，严忠亚，钟天鹰

(江苏省南京市妇幼保健院检验科 210004)



·临床研究·

罗氏公司Cobas E602电化学发光分析仪检测抗缪勒管激素的方法学评价

曾 玉，吴 畏，姚 辉，严忠亚，钟天鹰

(江苏省南京市妇幼保健院检验科 210004)

目的 对罗氏公司Cobas E602电化学发光分析仪检测抗缪勒管激素(AMH)进行方法学评价。方法 根据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)的EP文件要求，制订定量检测方法的方法学评价方案，即通过在罗氏公司Cobas E602电化学发光分析仪检测AMH的精密度、准确度、分析测量范围和携带污染率来评价其性能。结果 AMH低、中和高浓度时，批内精密度CV分别是1.971%、1.540%和1.707%，批间精密度CV分别为3.508%、3.072%和3.199%，均符合要求；多个不同浓度定值校准品的检测结果与靶值的相对偏倚均在±5%之内，且将已知浓度的AMH标本加入到健康人血清中，测得的添加回收率为97.05%～102.52%，准确度满足判断标准；分析测量线性范围为0.083～22.398 ng/mL，相关方程Y=0.987 7X+0.100 6(a值在0.95～1.05，r2≥0.95)；携带污染率为0.769%(≤2.0%)。结论 罗氏公司Cobas E602电化学发光分析仪检测AMH的精密度高、准确度好，具有良好的线性测量范围及携带污染率低，验证和评价标准符合，可为临床检测工作提供准确的参考依据。

Cobas E602； 电化学发光； 抗缪勒管激素； 方法学评价

抗缪勒管激素(AMH)是Jost于1947年首先在睾丸支持细胞内发现的。AMH是转化生长因子β超家族的生长和分化的反应调节剂的一个成员，在卵巢功能方面发挥着极其重要的作用，如评估卵巢储备功能，预测绝经年龄等。此外，AMH可为辅助生殖技术的个性化治疗提供可靠证据，可对卵泡池中的卵子数量与质量及卵巢反应性进行评估并预测卵巢过度刺激综合征的发生，在生殖领域中也有着广阔的应用前景。AMH正作为临床常用的生化指标，受到极度关注与应用[1-2]。德国罗氏公司研制的电化学发光法检测AMH为新近批准项目可进入临床应用，本科室最近引进该检测项目，现就罗氏公司Cobas E602电化学发光分析仪检测血清AMH的方法学进行评价，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集本院2015年10～12月门、急诊及住院患者的新鲜血清标本，分别混合低、中、高3种浓度水平血清用于批内和批间精密度、准确度、添加回收率、分析测量范围以及携带污染率评价。

1.2 仪器与试剂 仪器采用德国罗氏公司Cobas E602电化学发光分析仪，使用配套AMH试剂。

1.3 评价方案与实验方法

1.3.1 精密度评价 参照美国临床和实验室标准协会(NCCLS)的EP-5A评价方案[3]，使用Elecsys试剂、标本和质控品确定精密度。具体为常规IQC在控后按标本检测程序进行测定，选择收集的低、中和高3种浓度混合血清标本，1 d内连续重复测定20次，分别计算出批内精密度的标准差(S批内) 和变异系数(CV批内)；另将上述3种浓度的混合血清连续重复测定20 d，每天上下午各测定1次，分别计算出批间精密度的标准差(S批间)和变异系数(CV批间)。

1.3.2 准确度评价 参照NCCLS的EP15-A[4]评价方案，按照检测定值的参考物质计算偏差来验证：即将AMH校准品稀释至5个不同浓度，每个浓度校准品连续测定2次，计算结果均值，对检测结果与已知的“靶值”进行比对，计算检测值与靶值的相对偏倚(%)，计算公式：偏倚=(测定值-靶值)/靶值×100%，偏倚应小于或等于5.0%。将一定浓度的AMH标本加入到正常人血清中，计算添加回收率。

1.3.3 分析测量范围(AMR)评价 按照NCCLS的EP6-A文件[5]，先确定实验室AMH测定的重复性和线性的允许误差范围分别为2%和5%；再选择AMH浓度靠近厂家提供线性范围上限的患者血清标本作为高浓度血清(H)，AMH浓度低的患者血清标本作为低浓度血清(L)，按5H、4H+1L、3H+2L、2H+3L、1H+4L和5L的关系各自配制，形成系列浓度检测标本，用Cobas E602对系列浓度标本进行AMH检测，每个浓度水平测定2次，记录结果，对检测结果的均值和理论值进行直线回归统计。实测值与理论值作比较(偏离应小于10%)，以稀释后的理论值为横坐标X，实测值的平均浓度为纵坐标Y，数据采用直线回归统计处理，计算回归方程：Y=aX+b和相关系数r2，若a值在1±0.05范围内，且r2≥0.950，则可为真实的测量分析范围，作临床参考依据。

1.3.4 携带污染率的评价 取高浓度AMH血清标本连续测定3次，测定值分别为H1、H2、H3；再取低浓度HE4血清标本连续测定3次，测定值分别为L1、L2、L3，按公式计算携带污染率。携带污染率=(L1-L3)/(H3-L3)×100%。携带污染率应小于等于2.0%。

2 结 果

2.1 AMH精密度评价结果 参考NCCLS的EP-5A文件，用收集的低、中、高3种浓度混合血清做批内精密度和批间精密度，见表1。

表1 Cobas E602测定AMH的精密度评价结果

2.2 AMH准确度评价结果 参考NCCLS EP15-A文件，与AMH校准品的标定值相比，验证值的相对偏倚在±5%之间，见表2。

表2 Cobas E602测定AMH的准确度评价结果

将已知浓度的AMH标本加入到健康人血清中，测得的添加回收率为97.05%～102.52%。

2.3 AMH分析测量范围评价结果 选取AMH高浓度(22.398 ng/mL)和低浓度(0.083 ng/mL)血清，根据配制关系稀释并计算出6例标本的AMH水平，作为这些标本的理论预期值，以预期值为横坐标，实测均值为纵坐标，将实测值与理论值作比较(偏离应小于10%)，进行直线回归分析，观察其线性范围，计算Y=aX+b，结果显示a=0.987 7，r2=0.999 6，满足要求(a值在1±0.05范围内，相关系数r2≥0.95)，见表2，散点图见图1。因此，AMH浓度在0.083～22.398 ng/mL范围内线性良好。

表3 AMH分析测量范围评价

图1 AMH线性范围验证

2.4 AMH携带污染率结果 AMH的H1、H2、H3测定值分别是22.429、22.391和22.763 ng/mL；L1、L2、L3测定值分别是0.409、0.285和0.237 ng/mL。携带污染率=(L1-L3)/(H3-L3)×100%，计算得0.769%，携带污染率满足要求。

3 讨 论

AMH检测是在罗氏公司Cobas e602型全自动电化学发光免疫分析仪进行检测，该试剂盒为罗氏公司研发的采用电化学发光免疫法(ECLIA)测定。ECLIA是在电场作用下发生的化学发光反应，是电化学和免疫测定技术相结合的产物，是目前全球最先进的免疫标记分析技术之一。ECLIA基本原理为电化学发光过程产生的光信号强度与二价的三氯联吡啶钌[Rubpy3]2+的浓度呈线性关系。将二价的三氯联吡啶钌[Rubpy3]2+与免疫反应体系中的一种物质结合，经免疫反应、分离后，检测免疫反应体系中剩余二价的三氯联吡啶钌[Rubpy3]2+经上述过程后所发出的光，即可得知待检物的浓度。ECLIA技术是目前最先进的标记免疫测定技术之一，具有准确度高、灵敏度高、稳定性好、无放射性污染，而且操作简便，可实现完全自动化，检测速度快等特点，与传统的检测方法相比具有无可比拟的优越性[6]。

虽然Cobas E601检测系统为封闭系统，采用配套的试剂、质控品和标准品，但是每个实验室在水质、电压稳定性、实验室温湿度和人员操作习惯等条件方面存在差异，实际分析性能与厂家提供的性能参数不一定一致。因此，根据《医疗机构临床实验室管理方法》和《ISO15189:2008 医学实验室质量和能力认可准则》对目前临床实验室质量要求[7]，临床实验室在开展新的检测项目之前需对新检测系统(仪器、试剂、校准品等)进行必要的性能验证，确保检验系统可对临床应用满意，确保可靠性，方法学评价内容在操作过程中通常包括可报告的精密度、准确度、携带污染率等，其中准确度和精密度的测定为最主要的验证指标[3-4]。本研究通过Cobas E602检测系统测定AMH的相关性能指标进行检测，以验证厂家给定的AMH性能参数并评估AMH作为新的检测项目在临床应用的可行性。

根据NCCLS的EP-5A文件对批内和批间精密度的评估，结果显示AMH低、中和高浓度时，批内精密度CV分别是1.971%、1.540%和1.707%，批间精密度CV分别为3.508%、3.072%和3.199%，与罗氏厂家说明书提供的参数基本相同，且符合CLSI的EP-5A文件标准，表明该方法稳定性和重复性均很好，精密度属于可接受范围。根据EP15-A文件，选择AMH校准品的不同稀释浓度作为参考物质，每个浓度校准品连续测定2次，计算结果均值，对检测结果与已知的“靶值”进行比对，计算检测值与“理论靶值”的相对偏倚(%)，结果5个不同浓度的AMH样品相对偏倚均在±5.0%之内，满足要求，表明准确度可接受。

按照NCCLS EP6-A文件评价AMH的分析测量范围，用以验证该方法的高、低检测值之间是否呈线性关系，将高值和低值AMH标本按不同关系各自配制并根据各稀释点数据进行直线回归统计方法处理，得方程Y=0.990 3X+0.018 9，r2=0.999 6，可见a值在规定的0.95～1.05范围内，且r2≥0.95，表明AMH在0.083～22.398 ng/mL范围呈较好的线性相关，此可为真实实施的测量分析范围，为临床提供参考依据。但此线性范围的低值为0.083 ng/mL，略高于罗氏公司给予的AMH低值0.01 ng/mL，亦表明不同实验室之间存在差异。本研究将已知浓度的AMH标本加入到正常人血清中，测得的添加回收率为97.05%～102.52%，符合要求。另外，由于罗氏公司Cobas E602采用一次性加样系统，大大减少了携带污染，检测结果显示该系统携带污染率仅为0.769%。

综上所述，应用罗氏公司Cobas E602电化学发光分析仪检测AMH，精密度和准确度高，具有良好的线性测量范围及携带污染率低，验证和评价标准符合，可为临床检测工作提供准确的参考依据。

[1]王巧丽，舒婷婷，陈晓红，等．抗苗勒管激素与卵巢储备功能关系的研究进展[J]．国际检验医学杂志，2015，36(1)：104-105．

[2]Jamil Z,Fatima SS,Ahmed K,et al.Anti-Mullerian hormone:above and beyond conventional ovarian reserve markers[J].Dis Markers,2016，2016(3):1-9.

[3]NCCLS.EP5-A Evaluation of precision performance of clinical chemistry devices:approved guideline[S].Wayne,PA,USA:NCCLS,1999.

[4]NCCLS.EP15-A User demonstration of performance for precision and accuracy:approved guideline[S].Wayne,PA,USA:NCCLS,2001.

[5]NCCLS.EP6-A Evaluation of linearity of quantitative measurement procedures:a statistical approach approved guideline[S].Wayne,PA,USA:NCCLS,2003.

[6]田润华，郑春喜，王士珍．电化学发光免疫分析与临床应用[J]．齐鲁医学杂志，2004，19(5)：464-465．

[7] 中华人民共和国卫生部.医疗机构临床实验室管理办法[S].北京:卫生部,2006:6．

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.23.039

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1673-4130(2016)23-3338-03

2016-06-18

2016-09-08)