胶体金免疫层析试验检测乙肝两对半时HBsAg假阴性结果的处置*

王洪珍，陈小芳，钱粉红

(1.江苏省镇江市第四人民医院生殖中心 212001；2.江苏大学附属医院呼吸科，江苏镇江 212001)



·临床研究·

胶体金免疫层析试验检测乙肝两对半时HBsAg假阴性结果的处置*

王洪珍1，陈小芳1，钱粉红2△

(1.江苏省镇江市第四人民医院生殖中心 212001；2.江苏大学附属医院呼吸科，江苏镇江 212001)

目的 胶体金免疫层析试验(GICA)检测乙肝两对半时，对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)结果疑似假阴性的标本分别用酶联免疫吸附试验(ELISA)和时间分辨荧光分析法(TRFIA)定量试验进行HBsAg检测，并用抗体中和确认试验进行确认，以获得一个处理GICA检测HBsAg产生假阴性结果的可靠方法。方法 2014年1月至2015年2月用GICA检测乙肝两对半的标本3 078例，选取其中结果为单乙型肝炎核心抗体(抗-HBc)，或单乙型肝炎e抗体(抗-HBe)为阳性，或抗-HBc和抗-HBe同为阳性，而HBsAg、乙型肝炎表面抗体(抗-HBs)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)均为阴性的标本86例，分别用ELISA和TRFIA检测其HBsAg，对检测为阳性的标本进行抗体中和确认试验确认。结果 86例标本经抗体中和确认试验确认阳性的为35例；ELISA检出阳性标本28例，其中2例为假阳性 ；TRFIA检出阳性标本35例与抗体中和确认试验符合率100%。结论 GICA检测乙肝两对半时，对HBsAg结果疑似假阴性的标本可选用TRFIA进行复查确认。

乙型肝炎表面抗原； 胶体金免疫层析试验； 酶联免疫吸附试验； 时间分辨免疫荧光分析试验； 抗体中和确认试验

乙型肝炎(简称乙肝)在我国的发病率很高，乙肝表面抗原(HBsAg)是诊断HBV感染的重要标志物，HBsAg检查对乙肝的预防和治疗有重要意义[1]。目前检测HBV标志物的方法较多，镇江市第四人民医院门急诊患者常用胶体金免疫层析试验(GICA)检测乙肝两对半，GICA 虽然方便快速，但该方法灵敏度不高，对低浓度的HBsAg会出现假阴性结果。为获得一个处理GICA检测HBsAg产生假阴性结果的可靠方法，本文对GICA检测乙肝两对半时，HBsAg结果疑似假阴性的标本分别用酶联免疫吸附试验(ELISA)和时间分辨荧光分析法(TRFIA)定量试验进行HBsAg检测，并用抗体中和确认试验进行确认，现报道如下。

1 资料与方法

1．1 标本来源 2014年1月至2015年2月镇江市第四人民医院共有3 078例患者静脉血清用GIA检测乙肝两对半，选取其中单乙肝核心抗体(抗-HBc)，或单乙肝e抗体(抗-HBe)为阳性，或抗-HBc和抗-HBe同为阳性，而HBsAg、乙肝表面抗体(抗-HBs)、乙肝e抗原(HBeAg)均为阴性的标本，其中单抗-HBc阳性标本44例，单抗-HBe阳性标本3例，抗-HBc和抗-HBe同为阳性标本39例，共计86例。

1．2 仪器与试剂 全自动时间分辨免疫荧光仪EasyCuta，BIO-RAD model 550酶标仪，洗板机。GICA乙肝两对半测试卡为爱博生物医药(杭州)有限公司提供,ELISA)试剂盒由北京万泰生物药业股份有限公司提供,TRFIA定量检测试剂为苏州新波生物技术有限公司提供,HBsAg抗体中和确认试剂盒由珠海丽珠试剂股份有限公司提供。

1．3 方法 各方法严格按照操作说明书进行操作。GICA 在10 min和30 min各观测一次结果,以后者报告结果，30 min后判定无效。ELISA测定时，用洗板机洗板，用酶标仪测定各A 值，按盒内说明书计算Cutoff 值；每板设空白1 孔，阴、阳性对照血清各两孔；阴性对照孔A值≤0.10，阳性对照孔A值≥0.80，否则实验无效；阴性对照孔A值<0.05按0.05计算。TRFIA操作前按要求做好标准曲线,并作室内质量控制。HBsAg最终结果以HBsAg抗体中和确认试验结果为判断标准，HBsAg抑制率≥50%为阳性。检测流程：首先进行GICA乳胶板检测乙肝血清学标志物，筛选其单抗-HBc，或单抗-HBe为阳性，或抗-HBc和抗-HBe同为阳性，而HBsAg、抗-HBs、HBeAg均为阴性的标本，再用ELISA和TRFIA定量试验进行HBsAg检测，并对检测为阳性的标本进行HBsAg抗体中和确认试验确认。

2 结 果

2.1 HBsAg确认试验对ELISA和TRFIA检测HBsAg阳性结果的确认 入选的86例标本中，GICA结果为抗-HBc和抗-HBe同为阳性标本39例，经ELISA检测HBsAg为阳性的17例，经TRFIA检测HBsAg为阳性的20例；GICA结果为单抗-HBc阳性标本44例，经ELISA检测HBsAg为阳性的8例，经TRFIA检测HBsAg为阳性的12例；GICA结果为单抗-HBe阳性标本3例，经ELISA检测HBsAg为阳性的3例，经TRFIA检测HBsAg为阳性的3例。ELISA检测为阳性的合计28例占32.56%(28/86)，TRFIA检测为阳性的合计为35例占40.70%(35/86)，两种方法共检测出HBsAg阳性标本37例，经HBsAg抗体中和确认试验确认为阳性的为35例，见表1。

表1 HBsAg确认试验对ELISA和TRFIA检测HBsAg阳性结果的确认(n)

2.2 HBsAg TRFIA定量试验阴性的标本进一步检测分析结果 对51例TRFIA HBsAg定量试验阴性标本进一步检测分析，发现有29例抗-HBs阳性，占33.72%(29/86)。

3 讨 论

GICA 检测乙肝两对半具有方便快速、干扰因素少，可单个标本操作等优点，能满足急诊检验的需要，为门诊、急诊患者和无偿献血现场采血前检测乙肝标志物提供了便利条件。但是该方法灵敏度不高，HBsAg的检测限一般为1 ng/mL，对于HBsAg弱阳性标本的检出率不高，容易出现假阴性。本实验结果显示，入选的86例疑似HBsAg假阴性标本，最终确认有35例为HBsAg弱阳性，占40.70%(35/86)，对51例HBsAg阴性标本进一步检测分析，发现还有29例抗-HBs弱阳性，占33.72%(29/86)，因此GICA检测乙肝两对半，只能作为筛查方法，对于疑似HBsAg假阴性标本需要用更准确的方法进行复查后方能发出报告。

ELISA灵敏度较高、特异性较好，操作方便且不需要很精贵的仪器，各诊断指标都比较理想且成本较低,基本满足了临床需求，是目前国内基层医院检测HBsAg最常用的方法。但该方法的操作步骤较多，整个实验过程持续时间长，而且国产ELISA试剂盒的灵敏度一般在0.5 ng/mL，对HBsAg临界标本检测的正确率并不理想，对一些低水平的HBsAg检出能力有限，仍有漏检，会产生一定的假阴性。在本实验中，最终确认的35例HBsAg弱阳性标本，ELISA仅检出26例阳性。标本溶血、标本污染、标本放置过久、标本凝集不全、操作中的因素(孵育时间、洗板、加样量等)都有可能造成ELISA结果为假阳性。在本实验中，ELISA检出的28例HBsAg弱阳性标本，有2例为假阳性。

TRFIA HBsAg定量试验HBsAg检测的灵敏度、特异性明显提高，使HBsAg滴度表达很低的标本得以检出,灵敏度一般在0.2 ng/mL，并能检测变异的HBsAg，对临床诊断及流行病学调查有着重要意义。全自动时间分辨免疫荧光仪EasyCuta从标本加样到结果全部由仪器自动化完成，从而避免了人为误差产生，做到了自动、准确、快速。有研究者提出，对于低浓度的HBsAg应引起足够的重视[2-5]。本实验中，HBsAg水平低的标本，GICA和ELISA灵敏度不够而漏检的，经TRFIA检测后均被检出，并经HBsAg抗体中和确认试验最终确认，符合率100%。李金明[3]提出应重视对弱反应性标本的确认，排除假阳性，得出一个正确的结果，对患者负责。 ELISA不仅因灵敏度的原因会出现假阴性结果，且存在一定程度的假阳性，在操作中需要注意防范，对弱阳性标本也需要进一步复查确认，确保结果准确可靠。曹树正等[6]曾以微粒子酶免发光法(MEIA)来确认ELISA检测HBsAg产生假阴性的标本，经抗体中和确认试验确认，MEIA也存在一定的假阳性，其低反应标本仍要经过抗体中和确认试验来验证。而TRFIA结果准确、灵敏度高、特异性好，对HBsAg弱阳性标本有较好的检出率，检测变异的HBsAg能力也强。因此，GICA对乙肝两对半检测时，对其中单抗-HBc阳性，或单抗-HBe为阳性，或抗-HBc和抗-HBe同为阳性，而HBsAg、抗-HBs、HBeAg均为阴性的疑似HBsAg假阴性标本可用TRFIA HBsAg定量试验进一步检测确认，核定结果后再发正式报告。

[1]王海刚，丁磊，潘航，等.3种HBsAg检测方法的比较[J]．国际检验医学杂志，2014,35(12):1614-1615.

[2]王蕾，刘华，王雯静，等.低水平乙型肝炎表面抗原的检测及其临床价值评估[J]．微生物与感染，2009，4(1)：9-12．

[3]王文武,曹树正，杨杰，等．对乙型肝炎表面抗原弱阳性结果进行确认试验的应用研究[J]．检验医学，2010，25(4)：301-303．

[4]李金明．感染性疾病血清学检验中应重视对弱反应性标本的确认[J]．中华检验医学杂志，2006，29(7)：577-580．

[5]康炜，辛娜，尤涛，等．ROC曲线对ELISA检测HBsAg阳性判断值的确定及应用评价[J]．现代检验医学杂志，2010，25(6)：49-50．

[6]曹树正，王文武．乙型肝炎表面抗原ELISA 检测假阴性样本的分析[J]．现代检验医学杂志，2012，27(1)：9-10．

国家自然科学基金资助项目(81370119)。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.23.036

A

1673-4130(2016)23-3333-02

2016-06-12

2016-09-02)

△通讯作者，E-mail:zhaoqian604@126.com。