山东汉族人群63个Y-STR基因座突变观察及法医学应用

王新杰¹，许 欣，黄 磊²，魏金叶¹

(1.潍坊市公安局，山东 潍坊 261061；2.山东省公安厅，济南 250001)

山东汉族人群63个Y-STR基因座突变观察及法医学应用

王新杰¹，许 欣1,*，黄 磊²，魏金叶¹

(1.潍坊市公安局，山东 潍坊 261061；2.山东省公安厅，济南 250001)

目的 调查分析山东汉族人群63个Y-STR基因座的突变情况，并评价其法医学应用价值。方法 收集山东汉族人群1020对父子共2040份男性血样，采用自行设计引物，对63个Y-STR基因座进行复合扩增和毛细管电泳检测，统计各基因座的突变情况。对DYS481基因座使用PowerPlexY23引物与自行设计引物分别扩增，进行分型一致性检验。结果 1020对父子在其中53个基因座上共检出 244 次等位基因突变，平均突变率为3.8×10-3（95 % CI 3.3×10-3～4.3×10-3）,其中突变率最高的DYS713为18.6×10-3（95 % CI 11.3×10-3～28.9×10-3），突变率最低的DYS438等10个基因座为0.98×10-3（95% CI 0～5.5×10-3），绝大多数突变为一步突变（91.8 %），符合逐步突变的遗传规律，等位基因增加突变与等位基因减少突变比接近1:1。1020对父子中有214对父子在53个基因座上共观察到244次突变，其中一步突变224次，二步突变9次，三步突变2次，其他突变类型9次；176对父子仅1个基因座发生突变。使用两套引物，DYS481基因座在1020对父子中有1018对得到一致的分型结果，一致性为99.8 %。结论 本文63个Y-STR基因座中的高突变基因座在近亲个体识别时有一定作用，但在Y-STR数据库家系查询与父系鉴定应用中应予以注意。进行同一认定及亲缘鉴定时，同一案件应使用相同的引物序列。

法医物证学；Y-STR；突变率

Y染色体STR的单倍型父系遗传特点在诸如父系家族的亲权鉴定、男女混合或多人份男性混合斑中男性个体分型以及追溯父系迁移历史等方面具有独特的应用价值。Y染色体的检验已被广泛应用于各类刑事案件，Y-STR基因座多态性及突变情况逐渐受到重视[1-4]。本文针对山东汉族人群，采用自行设计引物，调查了63个Y-STR基因座的基因突变情况，为法医学亲权鉴定、数据库建设和家系排查等提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 样本及DNA提取

1020对父子共2040份男性血样本，为山东地区用于落户的三联体亲子鉴定中的父-子样本，且父-子均通过常染色体STR检验确定了亲子关系。

1.2 引物及标记

Y-STR基因座命名及碱基序列查自NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/）及相关文献[1-8]。设定所选目标基因座的片段大小范围后，在目标重复序列两侧用Primer Express®Software Version 3.0设计引物，引物由上海生物工程有限公司合成,正向引物标记。经单基因座引物筛选和复合扩增参数优化，使各基因座扩增产物基本达到平衡、特异的要求，最终建立YI、YII两个多重复合扩增体系。为检验不同引物的分型一致性，两个复合扩增体系均选择了DYS481基因座，其中YI体系中的引物为自行设计，YII体系中的引物与Promega公司PowerPlexY23中的该基因座引物一致，YI体系中扩增片段比YII体系中长300bp。

YI：DYS456、DYS389I、DYS437、DYS447、DYS389II、DYS438、DYS522、DYS549、DYS576为6-FAM，DYS460、DYS458、、DYS622、DYS390、DYS392、DYS448、DYS449、DYS643为 HEX，DYS391、Y-GATA-H4、DYS388、DYS19、DYS385a/b、DYS527a/b 、DYS533为 TAMRA，DYS393、DYS459a/b、DYS635、DYS439、DYS570、DYS627、DYS444、DYS481为ROX。

YII：DYS426、DYS481、DYS630、YPENTA1＊、DYS518II、YPENTA2＊、DYS443为6-FAM，DYS531、Y-GATA-A10、DYS587、DYS593、DYS722、DYS713、DYS645、DYF411S1＊＊为HEX，DYS446、DYS505、DYS607、DYS708、DYS557、DYS707、DYS520为 TAMRA，DYS434、DYS510、 DYS709、DYS552、DYS596、DYS508为ROX。

1.3 PCR扩增及产物分型检测

PCR直扩程序同STRtyper-27Y®试剂盒（海尔施基因科技有限公司）。总体积10 μ L，其中2×Buffer 5 μ L，引物混合物2 μL，bufferII(酶混合物)2 μL，纯水1 μ l，0.5 mm血卡一片。使用STRtyper-27Y®试剂盒matrix标准品对3130XL测序仪进行光谱校正，以007、9948的分型结果作为对照，自行制备Ladder并编写panel及Bin，用GeneMapperID3.2软件进行基因分析。

1.4 数据统计

分析1020对父子对样本Y-STR基因座分型，统计等位基因传递次数与出现突变次数，其中多拷贝基因座的等位基因传递次数则统计为相应拷贝数，用网站（http://statpages.org/ confi nt.html)方法计算突变率以及95 % CI（可信区间）值。

2 结果

DYS481基因座核心重复序列为[CTT]n，本研究在YI、YII两个复合扩增体系中均选用了此基因座，但长度相差300 bp,目的是为了检测不同引物分型结果的一致性。结果1020对父子中有1018对在两个体系中均得到一致的分型结果，一致性为99.8 %，与文献[9]报道相似；有两对父子在同一体系中分型一致、但在不同体系中分型不一致，YII复合体系分型为22，YI复合体系分型为23.1，分析YI复合体系的DYS481扩增片段在引物结合区之间的重复区侧翼序列上有4个碱基插入，有待测序证实。这提示我们在进行同一认定及亲缘鉴定时，同一案件应使用相同的引物序列。

1020对父子样本中，806对父子未观察到突变（79.019 %），214对父子观察到突变（20.98 %）。在1020对父子中， 176对表现为一个基因座出现一步突变，占17.255 %，与未突变父子对累计占总观察数的96.275 %。在另外38对父子突变中，有19对观察到2个基因座出现一步突变，一对观察到3个基因座出现一步突变，7对观察到1个基因座出现二步突变，3对观察到2个基因座一步、二步突变各出现一次， 2对观察到1个基因座出现三步突变，其他突变形式见表1，没有观察到四个以上基因座同时出现突变。

1020对父子样本除DYS392等10个基因座未发现基因突变外，在其他53个基因座上共检出 244次等位基因突变，平均突变率为3.8×10-3（95 % CI3.3×10-3～4.3×10-3）。其中突变率最高的DYS713为18.6×10-3（95 % CI 11.3×10-3～28.9×10-3），突变率最低的DYS438等10个基因座为0.98×10-3（95% CI 0～5.5×10-3）。在检测出的244 次突变中，绝大多数突变为一步突变（91.8 %），符合逐步突变的遗传规律。总体上一步突变中n+1突变（50.9 %）略高于n-1突变（49.1 %），但在每个基因座中表现差异很大，如高突变基因座DYS576中n-1突变占75 %，而DYS449基因座n+1突变则占75 %，所发现的二步、三步突变均为减少重复单位突变（表2）。实验中在单拷贝基因座上发现了单带→双带突变、双带→单带突变、单带→谱带缺失突变，双拷贝基因座发现了单带→双带以及双带→单带、三带突变甚至双带→谱带缺失突变。DYS385a/b、DYS527a/b、DYS459a/ b、DYF411S1＊＊等双拷贝基因座，在所检验样本中，发现有些个体出现了三、四个扩增片段，有些个体出现谱带缺失。除上述4个双拷贝基因座外，55个单拷贝基因座有部分基因座在一些个体检出两个扩增片段，而DYS448等多个基因座检出谱带缺失，类似情况已有文献报道[10-11]，上述现象均可经遗传传递，但其发生原因有待染色体分析或测序证实。

表1 山东地区汉族人群1020对父子63个Y-STR基因座突变分布情况Table 1 Allele mutations distribution of 1020 father-son pairs at 63 Y-STR loci in Shandong Han population

表2 山东地区汉族人群63个Y-STR基因座突变情况及基因多样性对照表(n代表父亲的重复单位数)Table 2 Mutations of 63 Y-STR loci and their comparison of gene diversity in Shandong Han population (n=number of repeat units of father)

3 讨论

本文63个基因座中除10个基因座未检出突变外，其余53个基因座共检出 244 次等位基因突变。53个突变基因座中DYS713突变率最高，为18.6×10-3（95 % CI 11.3×10-3～ 28.9×10-3）； 其次 是DYS576， 为15.7×10-3（95 % CI 9.0×10-3～25.3×10-3）；DYS438等10个基因座突变率最低，为 0.98×10-3（95 % CI 0～ 5.5×10-3）。63个 基 因座的平均突变率为3.8×10-3（95 % CI 3.3×10-3～4.3×10-3），与相关文献报道的[12-16]美国白人突变率1.7×10-3（95 % CI 1.1×10-3～2.5×10-3）、黑人突变率3.0×10-3（95 % CI 2.2×10-3～4.0×10-3）及广东汉族人群2.2×10-3（95 % CI 1.6×10-3～3.0×10-3）相比均要高，显示不同人群间突变率可能有一定差异，也可能与本文涉及的高突变基因座较多有关。对山东汉族人群与广东汉族人群突变调查所采用的共有的24个基因座分析发现，DYS630、DYS622、DYS449、DYS570、DYS481、DYS522、DYS557、Y-GATA-A10、DYS446、DYS459a/b等基因座在二个人群中突变率有明显差异，如山东汉族人群的突变率分别为14.71×10-3、5.88×10-3、13.73×10-3、7.84×10-3、2.94×10-3、2.94×10-3、2.94×10-3、5.88×10-3、5.88×10-3、1.47×10-3，而在广东汉族人群中，突变率[14]分别为7.5×10-3、0.0×10-3、2.5×10-3、3.75×10-3、5.0×10-3、0.0×10-3、0.0×10-3、2.5×10-3、2.5×10-3、0.0×10-3，此差异来自不同人群还是与抽样有关，尚有待进一步研究。

本文244次突变分析显示，绝大多数突变为一步突变（91.8 %），符合逐步突变的遗传规律。总体上一步突变中n+1突变（50.9 %）略高于n-1突变（49.1%），但在每个基因座中表现差异很大，如高突变基因座DYS576中n-1突变占75 %，而DYS449基因座n+1突变则占75 %，具体原因尚不清楚。所发现的二步、三步突变均为减少重复单位突变，与复制时模板DNA链易发生滑脱有关。实验中在单拷贝基因座发现的单带→双带突变、双拷贝基因座发现的单带→双带、双带→单带、三带突变为Y染色体复制异常所致。而单带、双带→谱带缺失突变应与引物结合区变异或大片段缺失有关，需染色体分析或测序证实。

在1020对父子中，由于基因突变，214对父子（20.98 %）可以用本研究使用的Y-STR基因座进行区分，这一研究为一些涉及男性近亲而只能检出Y-STR分型的特殊案件提供了新思路。53个突变基因座中，DYS576(15.67 ‰)、DYS449(13.73 ‰)、DYS630(14.71 ‰)、DYS713(18.63 ‰)等突变率均超过10 ‰，此类基因座更适合于父子、兄弟等近亲的同一认定，而不宜用于亲缘关系鉴定及Y-STR数据库建设。而本次实验没有观察到突变且GD值较高（如＞0.5）的DYS392、DYS448、DYS643、DYS443、DYS531、DYS593、DYS596等基因座应与商业化试剂盒选用的突变率低于或接近常染色体STR平均突变率（2‰）且GD值较高（如＞0.5）的DYS456、DYS437、DYS447、 DYS522、DYS460、DYS390、Y_GATA_H4、DYS19、DYS385a/b、DYS533、DYS393、DYS444、DYS481、DYS587、DYS557等基因座作为亲缘关系鉴定及Y-STR数据库建设的首选，并可增加符合上述要求的非商业化试剂盒中的DYF411S1＊＊、DYS505、DYS607、DYS708、DYS707、DYS520、DYS510等基因座。

综上所述，本文63个Y-STR基因座中大多数基因座适合山东汉族人群法医学应用，其中53个基因座观察到突变，在Y-STR数据库查询及亲缘关系鉴定中应引起重视。该研究提供的多个多态性好、突变率低的基因座可用于Y-STR数据库建设及亲缘鉴定，同时确立了一批多态性好、突变率高的基因座用于特殊案件的个体识别。

［1］ Hou YP, Zhang J, Li YB, et al. Allele sequence of six new Y-STR loci and haplotypes in the Chinese Han population ［J］. Forensic Sci Int, 2001,118(2-3): 147-152.

［2］ Bosch E, Calafell F, Pezaun A,et al. Y chromosome STR haplotypes in four populations from northwest Africa ［J］. International Journal of Legal Medicine, 2000, 114(12): 36-40.

［3］ Schoske R, Vallone PM, Kline MC, et al. High-throughput Y-STR typing of U.S populations with 27 regions of the Y chromosome using two multiplex PCR assay ［J］. Forensic Sci Int, 2004, 139(2-3): 107-121.

［4］ Annable GN, Mike E, Maria VL, et al. Sequence structure of novel Y chromosome micro-satelites and PCR amplifi cation strategies［J］. Forensic Sci Int, 2001, 122:19.

［5］ Hanson EK, Ballantyne J. An ultra-high discrimination Y chromosome short tandem repeat multiplex DNA typing system ［J］. PLoS One, 2007, 2(8): e688.

［6］ Järve M, Zhivotovsky LA, Rootsi S, et al. Decreased rate of evolution in Y Chromosome STR loci of increased size of the eepeat unit ［J］. PLoS One, 2009, 4(9): e7276.

［7］ Kayser M, Kittler R, Erler A, et al. A comprehensive survey of hu-man Y-chromosomal microsatellites［J］. Am J Hum Genet, 2004, 74: 1183-1197.

［8］ 刘宏. 24个Y-STR基因座荧光标记复合检测体系的建立及其法医学应用［D/OL］. 广州：南方医科大学，2012. http://www.doc88.com/p-2317081397429.html.

［9］ Butler JM. 法医DNA分型专论：方法学：第三版［M］. 候一平，李成涛,主译. 北京:科学出版社,2013:161-162.

［10］ 吴微微, 苏艳佳,章申峰,等.Y-STR基因座的特殊分型现象［J］ .法医学杂志, 2008,24（5）: 355,360.

［11］ 吴微微, 郝宏蕾,苏艳佳,等.Y-STR基因座分型缺失分析［J］.中国法医学杂志, 2009, 24（3）: 186-188.

［12］ Weng W, Liu H, Li S, et al. Mutation rates at 16 Y- chromosome STRs in the South China Han population［J］. International Journal of Legal Medicine, 2013, 127(2):369-372.

［13］ Ge J Y, Budowle B, Aranda X G, et al. Mutation rates at Y chromosome short tandem repeats in Texas population ［J］. Forensic Sci Int Genet, 2009, 3(3): 179-184.

［14］ 孙凯臻, 彭珊,刘超,等.广东汉族群体24个Y-STR基因座的多态性及突变率［J］ .中国法医学杂志, 2014,29（6）: 514-518.

［15］ 赵丽, 张艳霞,李爱强. Y-STR家系遗传分析破获凶杀案1例［J］.刑事技术，2011（2）: 64-65.

［16］ 朱传红,周翔,邵毅,等.湖北地区汉族人群24个Y-STR基因座遗传多态性研究［J］.刑事技术，2014（1）: 16-22.

Mutations at 63 Y-STR Loci in Shandong Han Population and the Forensic Applicability

WANG Xinjie1, XU Xin1,*, HUANG Lei2, WEI Jinye1
(1. Weifang Public Security Bureau, Shandong, Weifang 261061 China; 2. Shandong Provincial Public Security Department, Jinan 250001, China)

Objective To investigate the mutations at 63 Y-STR loci in Shandong Han population and evaluate their forensic applicability. Methods Bloodstain samples of 1020 father-son pairs in Shandong Han population were DNA-typed by conducting YI and YII PCR multiplex amplification with a five-color fluorescence labeling 35 and 29 Y-STR loci. The mutations were calculated and the typing accuracy was checked by comparing the typing result of DYS481 from PowerPlexY23 primers with that of the designed primers. Results Among the 1020 father-son pairs, 244 mutations were detected from 53 genetic loci of 63 ones, the average mutation rate was 3.8×10-3(95 % CI 3.3×10-3～4.3×10-3) per locus. The highest mutation rate at DYS713 was 18.6×10-3(95% CI 11.3×10-3～28.9×10-3), the lowest mutation rate of ten loci was 0.98×10-3(95 % CI 0～5.5×10-3), and the vast majority of mutations was one-step mutation (91.8 %), in consistency with the gradual mutation of the genetic law, and the allele increase or decrease from the mutation was 1:1. 224 mutations were onestep event, 9 mutations were the two-step's, 2 mutations were three-step's, other mutations occurred 9 times. The mutat ions in 176 father-son pairs happened at single locus. 1018 pairs of 1020 father-son pairs got the consistent results using two sets of primers in DYS481 loci, the consistency was 99.8 %. Conclusion The loci of high mutation rate is effective for the individual identifi cation but should be cautious when the Y-STR database searching and patrilineal identifi cation are recruited. During the parentage determination and individual identifi cation, the same primers should be used for the same case.

forensic biological evidence; Y-STR; mutation rate

DF795.2

B

1008-3650(2016)05-0424-05

2015-08-03

格式：王新杰，许欣, 黄磊，等. 山东汉族人群63个Y-STR基因座突变观察及法医学应用[J]. 刑事技术，2016,41(5):424-428.

10.16467/j.1008-3650.2016.05.020

王新杰（1973—），男，山东昌邑人，学士，副主任法医师，研究方向为法医物证学。E-mail: wfxjfy@aliyun.com

* 通讯作者：许欣（1982—），男，山西太原人，学士，法医师，研究方向为法医物证学。E-mail:uiruir@aliyun.com