PDTC对惊厥持续状态大鼠海马细胞凋亡及TLR4、caspase-3表达的影响

周琴 张勤 李光乾 周素芽

●论 著

PDTC对惊厥持续状态大鼠海马细胞凋亡及TLR4、caspase-3表达的影响

周琴 张勤 李光乾 周素芽

目的 观察大鼠惊厥持续状态后海马中Toll样受体4（TLR4）、NF-κB和半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的动态表达及神经细胞凋亡的变化，探讨吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）对惊厥后脑损伤的可能保护机制。方法 将106只SD大鼠随机分为0.9%氯化钠组（A组）、SC组（B组）和PDTC组（C组），B组根据大鼠惊厥后处死时间（4、24、48和72h），分为B1～B4组，B组和C组大鼠惊厥持续状态模型的制作采用氯化锂-匹罗卡品法，C组在大鼠制模成功后，每天腹腔注射PDTC（100mg/kg）1次，连用3d，于惊厥后72h处死。电镜观察海马超微结构改变；免疫组化法测定大鼠海马NF-κB/p65的表达；RT-PCR法检测海马TLR4、caspase-3 mRNA表达的动态变化；TUNEL法检测神经细胞凋亡数的变化。结果 B组大鼠海马神经元超微结构损伤存在动态变化，72h内病变进行性加重；C组大鼠病理改变较B4组减轻。B1～B4组海马神经元胞核内有不同程度NF-кB/p65的表达，且较A组明显升高（P＜0.05或0.01）。C组较B4组NF-κB/p65表达明显下降（P＜0.01）。B1～B4组TLR4、caspase-3 mRNA的表达量均高于A组（P＜0.05或0.01），且随时间延长逐渐升高，72h达到高峰；C组TLR4、caspase-3 mRNA的表达较B4组明显降低（P＜ 0.05）。B组在惊厥24h后海马CA1区TUNEL阳性细胞数已明显高于A组（P＜0.01），72h达高峰，而C组TUNEL阳性细胞数较B4组明显下降（P＜0.01）。结论 惊厥持续状态后大鼠海马TLR4、NF-κB/p65和caspase-3的表达增强。NF-κB抑制剂PDTC可以下调TLR4和caspase-3的表达，并使神经细胞凋亡减轻；提示TLR4/NF-κB信号通路在惊厥后海马细胞凋亡的发生、发展过程中起促进作用。

惊厥 凋亡 Toll样受体4 NF-κB 半胱氨酸蛋白酶-3 吡咯烷二硫代氨基甲酸盐

【 Abstract】 Objective To investigate the effects of pirrolidine dithiocarbamate(PDTC)on expression of TLR4,NF-кB, caspase-3 and the change of neuron apoptosis in hippocampus of status convulsion rats. Methods One hundred and six male Sprague-Dawley（SD）rats were randomly divided into control group(A),convulsion group(B)and PDTC group(C).then group B were randomly divided into four subset groups (B1-B4),which would be executed at 4h,24h,48h,72h after convulsion discontinued.Continuous epilepticus was induced by injecting lithium chloride and pilocarpine,and rats in group C were daily injected with 100mg/kg PDTC 30 min after convulsion discontinued for 3 days.The histopathological changes in hippocampus were observed with electron microscope,NF-κB/p65 protein was detected by immunohistochemistry(IHC),the expression of TLR4 and caspase-3 mRNAwas detected by RT-PCR.The neuron apoptosis was examined by TUNEL.Results Neuronal injury was observed in group B with electron microscope,and the change was increased gradually after seizure induced;neuronal injury in group C was milder than that in group B at 72h.IHC staining showed that more positive expression of NF-кB/p65 was observed in nuclei of hippocampal neurons in group B,compared with group A (P＜0.05),and the protein expression of NF-кB/p65 in group C was much lower than that in group B4(P＜0.01).The mRNA expression of TLR4 and caspase-3 in rat hippocampus of group B was significantly elevated than that in group A(P＜0.05);and the tendency was increased gradually reaching the peak at 72 h after seizure,and that in group C was much lower than that in B4 group(P＜0.01).The TUNEL positive cells in hippocampus CAlofgroup B were more than those ofgroup A at 24h after seizure(P＜0.01)reaching the peak at 72h;andthe TUNEL positive cells in group C were lower than those in B4 group(P＜0.01). Conclusion The expression of TLR4,NF-кB and caspase-3 increased after SC in rats.PDTC can down-regulate the expression of TLR4 and caspase-3 and inhibit neuronal apoptosis in hippocampus ofrats with pilocarpine-induced seizures.These results suggest that TLR4/NF-κB may have protective effect on the development ofthe hippocampus apoptosis caused by status convulsion.

有研究发现，持续惊厥发作后将导致以海马区为主的选择性脑损伤，而神经细胞的死亡分为坏死与凋亡，坏死是被动的突发性细胞肿胀与溶解过程，凋亡则属于主动程序性细胞死亡[1]。因细胞凋亡可以被调控，故其在惊厥后脑损伤中的作用日益受到关注。研究表明，免疫炎症反应参与了惊厥引起的脑损伤过程[2]，笔者之前研究发现，惊厥持续状态后大鼠海马Toll样受体4（Tolllike receptor 4，TLR4）/NF-κB信号通路被激活，并促进了惊厥持续状态后大鼠海马的损伤[3]。现进一步研究在惊厥持续状态大鼠海马神经元凋亡中TLR4/NF-κB信号通路的可能作用。

1 材料和方法

1.1 材料 清洁级雄性SD大鼠106只，体重180～220g，由温州医科大学实验动物中心提供。溴化甲基东莨菪碱（S8502）、吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC）（P8765）由美国Sigma公司提供，氯化锂（K73036）、匹罗卡品（K80477）由美国Fluka公司提供。兔抗大鼠NF-κB/p65一抗（RAB-9034）为LAB VISION公司产品，即用型免疫组化二抗试剂盒（KIT-5004）、DAB显色剂（DAB-0031）由福建迈新公司提供。RT-PCR试剂盒（DRR023A）为日本TaKaRa公司产品，TRI Reagent总RNA提取试剂盒（TR-118）购自美国MRI公司。TUNEL试剂盒（ZK-8005）由瑞士Roche公司提供。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与模型制作 大鼠随机分为0.9%氯化钠组（A组，16只）、惊厥持续状态组（B组）和PDTC组（C组，18只），其中B组根据大鼠惊厥后处死时间（4、24、48和72h）分为B1～B4组，每组18只，A组和C组于惊厥后72h处死。惊厥持续状态模型制作方法如下：大鼠先予腹腔注射127mg/kg的氯化锂，18h后予溴化甲基东莨菪碱1mg/kg，30min后予注射匹罗卡品45mg/ kg。大鼠惊厥程度按Racine分级标准分为6级：0级，无惊厥发作；Ⅰ级，面部抽动；Ⅱ级，节律性点头；Ⅲ级，前肢阵挛抽搐；Ⅳ级，全身强直伴站立；Ⅴ级，全身强直阵挛。当大鼠惊厥时间达30min时予阿托品1mg/kg、10%水合氯醛400mg/kg腹腔注射。惊厥程度达Ⅳ级以上、持续达30min的为合格惊厥持续状态大鼠模型。A组以等量的0.9%氯化钠代替匹罗卡品，其余用药同B组。C组在大鼠惊厥停止后30min，给予每天腹腔注射1次100mg/kg的PDTC，连用3d。

1.2.2 电镜标本制作与观察 每组中任选2只大鼠脑海马组织，2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，作海马CA1区半薄切片，600A超薄切片，日立H600透射电镜观察神经细胞超微结构变化。

1.2.3 免疫组化法测定海马NF-κB/p65的表达 每组随机取10张大鼠海马组织的石蜡切片，采用免疫组化法检测NF-κB/p65表达。随机取5个高倍视野（×400），测定阳性部位的平均吸光度（A值），累积吸光度（IA值），同时测定NF-κB/p65的核阳性细胞百分比。

1.2.4 RT-PCR检测大鼠海马TLR4、半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）mRNA表达 每组随机取6只海马标本，称取50～100mg制作匀浆，逆转录反应按试剂盒说明书进行。用β-actin作为PCR反应的内参照，引物序列及反应条件：（1）β-actin：5′-CTACAATGCTGCGT GTGG-3′，5′-ATGGCTACGTACATGGCTGG-3′，产物长度138bp。（2）caspase-3：5′-CTGGACTGCGGTATTGAG-3′，5′-ACGG GATCTGTTTCTTTG-3′；94℃预变性3min后，94℃变性30s，59℃复性30s，72℃延伸1min，循环32次，72℃延伸5min终止，产物长度289bp。（3）TLR4：5′-GCCGGAAAGTTATTGTGGTGGT-3′，5′-ATGGGTTTTAGGCGCAGAGTTT-3′；94℃预变性3min后，94℃变性30s，59℃复性30s，72℃延伸1min，循环32次，72℃延伸5min终止，产物长度356bp。用SmartView分析产物光密度值。

1.2.5 TUNEL检测海马CA1区神经元凋亡 每组随机取10只大鼠的切片，TUNEL法检测海马神经元凋亡细胞的表达。随机取5个高倍视野（×400），取其平均值，统计TUNEL阳性细胞数。

1.3 统计学处理 应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。两变量的相关性分析采用Pearson等级相关。

2 结果

2.1 电镜观察海马CA1区超微结构 A组大鼠海马CA1区核膜完整光滑，神经元结构清楚，线粒体，粗面内质网和游离核糖体丰富（图1，见插页）。B1组CA1区神经纤维间隙水肿，少量连接模糊。B2组神经元细胞间隙明显扩张，核致密度增加，核膜皱缩曲折，内质网轻度扩张，线粒体明显肿胀。B3和B4组，神经元出现凋亡样改变：表现为细胞核及细胞质固缩，结构致密，但核膜完整，多数线粒体、高尔基体均出现扩张、空泡样改变，呈“暗神经元样”改变（图2，见插页）。C组与B4组相比，海马水肿范围减小，程度有所减轻；内质网和高尔基体仍轻度扩张；线粒体仍有肿胀，但空泡样变性少见；神经元细胞仍可见核固缩，但无“暗神经元”改变（图3，见插页）。

2.2 各组大鼠海马CA1区NF-κB/p65免疫组化结果及核阳性细胞的比较 A组海马中NF-кB/p65主要表达于细胞质，细胞核无染色。B1～B4组与A组比较，均有不同程度的NF-κB核阳性细胞表达于神经元和少量胶质细胞中，差异有统计学意义（P＜0.05）；于惊厥4h后NF-κB/p65即出现核转移，达峰于惊厥后72h（P＜0.01）；C组与B4组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），详见表1、图4-6（见插页）。

表1 各组大鼠海马CA1区NF-κB/p65免疫组化结果及核阳性细胞的比较

2.3 各组大鼠海马TLR4、caspase-3 mRNA表达的比较 A组大鼠海马仅表达极少量的TLR4 mRNA；B组随观察时间的延长，TLR4 mRNA的表达量逐渐增加，于惊厥后72h达到峰值，与A组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），与B4组比较，C组的TLR4 mRNA表达量明显降低（P＜0.05）。caspase-3 mRNA在A组海马仅有少量表达，B组随观察时间的延长caspase-3 mRNA的表达量进行性增加，于惊厥后72h达到峰值，与A组比较，均有明显升高（P＜0.05），与B4组相比，C组caspase-3 mRNA的表达量明显降低（P＜0.05），详见表2、图7-8。

表2 各组大鼠海马TLR4、caspase-3mRNA表达的比较

图7 各组大鼠海马TLR4mRNA表达电泳图

图8 各组大鼠海马caspase-3mRNA表达电泳图

2.4 大鼠海马CA1区TUNEL检测结果 A组少量TUNEL阳性细胞表达于大鼠海马CA1区。B组TUNEL阳性细胞数逐渐增加，于72h达到峰值，相较A组，有统计学差异（P＜0.01）。与B4组相比，C组TUNEL阳性细胞数明显下降（P＜0.01），但仍较A组高（P＜0.01），详见表3、图9-11（见插页）。

2.5 相关性分析 TLR4mRNA与NF-κB/p65、caspase-3mRNA的表达均呈正相关（r＝0.572、0.704，均P＜0.01）；TUNEL阳性细胞数与TLR4 mRNA、NF-κB/p65与caspase-3 mRNA的表达均呈正相关（r＝0.823、0.580、0.649，均P＜0.01）。

表3 各组大鼠海马CA1区TUNEL阳性细胞数的比较（个/HP）

3 讨论

惊厥持续状态易引起海马区为主的选择性脑损伤，这种损伤包括神经细胞的坏死与凋亡，而细胞凋亡受到一系列程序性调控的影响，可通过早期加以干预而逆转。因此，惊厥持续状态后神经元凋亡的预防，对于减轻惊厥性脑损伤具有重要意义。

笔者发现在惊厥持续状态后，大鼠海马CA1区出现不同程度的神经元凋亡样改变，且在惊厥后早期（4h）即可见到早期凋亡细胞，随后逐步出现凋亡晚期改变，其病变程度随观察时间延长逐渐加重，至惊厥后72h可见“暗神经元”样改变，提示大鼠在惊厥持续状态后，虽然没有再次出现惊厥发作，但脑内的神经损伤在惊厥持续状态后的3d内仍呈现进一步加重过程。PDTC干预后能减轻惊厥后海马组织的病理损伤，减少凋亡细胞的产生，与文献报道相符[4]。

caspase是直接导致细胞凋亡的蛋白酶系统，位于细胞凋亡机制中的核心地位[5]。其中caspase-3为凋亡的最终执行者，活化后可降解细胞核、细胞骨架及细胞质中的重要蛋白质，最终导致细胞凋亡。Sun等[6]在海人藻酸诱导的惊厥持续状态大鼠模型中发现，免疫组化和western blot结果表明caspase-3显著增加，RT-PCR提示大鼠海马caspase-3 mRNA表达明显增加，达峰于惊厥后72h。本研究结果显示，caspase-3 mRNA的表达在惊厥后早期（4h）已有升高（P＜0.05），且随观察时间的延长逐步升高，达峰于惊厥后72h，其动态变化与TUNEL检测的神经元凋亡的规律一致，与文献报道类似[6]。这一结果证实caspase-3的活化与惊厥发作后的神经元凋亡密切相关。

TLR4是一种跨膜识别受体，分为细胞外、细胞膜和细胞内3部分，在CNS可表达于神经细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞等[7]。TLR4活化后，主要通过TRIF和MyD88依赖的两条信号通路激活NF-κB，活化的NF-κB进入细胞核进行转录调控，诱导细胞凋亡的产生[8]。在小鼠癫痫模型中发现，在癫痫小鼠海马神经元、小胶质细胞、星型胶质细胞中均有大量TLR4的表达，抑制TLR4后癫痫发作程度减轻[9]。而敲除TLR4基因的C3H/HJ型小鼠能抑制癫痫的发作[10]。本研究发现，TLR4 mRNA的表达在惊厥后4h已有所升高，且随观察时间的延长进一步增加，达峰于惊厥后72h，提示在惊厥性脑损伤大鼠海马细胞中TLR4被活化，且NF-κB表达量的增加与TLR4的上调呈正相关，说明TLR4活化的同时伴有细胞核内NF-κB的激活。由此可见，惊厥发作可激活TLR4/NF-κB通路，活化后的TLR4的作为重要的炎性受体介导惊厥持续状态的免疫损伤。

但TLR4/NF-κB通路的激活是否与惊厥持续状态后神经细胞凋亡密切关联呢？在海人酸所致的癫痫小鼠模型中发现，NF-κB的活化促进了海马神经元凋亡的发生，而抑制NF-κB可显著减少神经细胞的凋亡，表明NF-κB的激活与惊厥后神经细胞的凋亡密切相关[11]。研究小胶质细胞的凋亡机制后发现，活化的TLR4可以上调NF-κB的表达，NF-κB活化后进入细胞核内激活caspase-11，最终引起caspase-3的活化而促使细胞凋亡发生[12]。本研究结果表明，惊厥后大鼠海马TLR4/NF-κB通路的激活与caspase-3的表达和凋亡细胞数有显著相关，因此，笔者推测TLR4/NF-κB信号通路可能通过活化caspase-3参与了惊厥后海马细胞凋亡的发生。

PDTC是一种NF-κB活化的抑制剂，在多种细胞中可以抑制NF-κB的活性[13]。Pfeilschifter等[14]在小鼠中风模型中发现，PDTC可以通过激活p38 MAPK信号途径减少脑梗死面积及减轻脑血管内皮细胞的凋亡。Wang等[15]研究新生大鼠缺血缺氧性脑病模型发现，PDTC可以下调caspase-3的表达，减少NF-κB的核易位和海马神经细胞的凋亡，从而减轻缺血缺氧引起的脑损伤。本研究结果显示，PDTC可以减轻惊厥持续状态后大鼠海马组织的病理损伤，其原因可能是由于PDTC抑制了NF-κB的活性，使caspase-3的表达下降，从而减轻了细胞凋亡的程度。从RT-PCR的结果看，PDTC也抑制了TLR4的表达，这可能与NF-κB的活性被PDTC阻断了有关。TLR4的活化激活了NF-κB，而活化的NF-κB对TLR4也有反馈作用。有研究发现，LPS、γ-干扰素（IFN-γ）、IL-1β等可以增加TLR4在内皮细胞中的表达，PDTC可以抑制由它们活化的TLR4表达上调，同时正常细胞中TLR4的表达也受到PDTC的抑制，这一结果提示TLR4的表达依赖于NF-κB调节[16]。Zhao等[17]研究也提示，抑制NF-κB的活性可以下调TLR4在树突状细胞表面的表达。TLR4激活NF-κB的途径至今研究较多，但NF-κB如何调控TLR4的机制目前还不明了。也许是NF-κB激活的细胞因子诱导了TLR4的表达，也可能是NF-κB的核转移诱导了TLR4基因的转录，这些都还需要深入的研究。

综上所述，惊厥持续状态后海马中存在神经细胞的凋亡，TLR4/NF-κB信号通路可能通过caspase-3来介导这一细胞损伤。PDTC可能通过抑制TLR4/NF-κB通路来减轻惊厥后神经细胞的凋亡，为惊厥后脑损伤的保护机制提供可能的依据。

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（本文编辑：严玮雯）

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本刊编辑部

Effects of PDTC on expression of Toll-like receptor 4,caspase-3 and neuron apoptosis in hippocampus of status convulsion rats

ZHOU Qin,ZHANG Qin，LI Guangqian,et al.Department of Pediatrics,Zhejiang Provincial People's Hospital,Hangzhou 310014,China

Convulsion Apoptosis Tolllike receptor 4 NF-κB Caspase-3 PDTC

2015-12-11）

浙江省中医药科学研究基金计划（2011ZB014）

310014 杭州，浙江省人民医院儿科（周琴、张勤）；杭州市儿童医院神经科（李光乾、周素芽）

周素芽，E-mail：suya.zhou@163.com