一株化血胆组织培养污染内生细菌的分离鉴定及防治

赵 凤，耿开友*，胡 昳，夏体渊，陈泽斌，任 禛，靳 松

(1. 昆明学院科研处，云南 昆明 650214; 2. 昆明学院农学院，云南 昆明 650214)



一株化血胆组织培养污染内生细菌的分离鉴定及防治

赵 凤1，耿开友1*，胡 昳2，夏体渊2，陈泽斌2，任 禛2，靳 松2

(1. 昆明学院科研处，云南 昆明 650214; 2. 昆明学院农学院，云南 昆明 650214)

采用NA培养基分离纯化细菌，通过形态特征、生理生化指标结合16S rDNA序列同源性分析，对引起化血胆组培苗污染的内生细菌进行鉴定。结果表明，引起化血胆组培苗污染的内生细菌为HXD5菌株，其形态特征及22项生理生化指标与枯草芽孢杆菌相符；16S rDNA序列分析发现，HXD5与B.amyloliquefaciens(HQ727971)、B.vallismortis(FJ386541)、B.licheniformis(EF644414)、B.subtilis(AY583216)在同一系统发育分支，同源性为99.9 %～100 %。因此确定引起化血胆组培苗污染的内生细菌HXD5为枯草芽孢杆菌。抑菌试验表明，氯霉素对HXD5的抑菌效果要优于链霉素。

化血胆；组织培养；内生细菌；分离；鉴定；防治

化血胆为玄参科植物黑蒴[Melasmaarvense(Benth.) Hand.-Mazz.]的根，系多年生草本植物，主要分布于云南省南部地区，为云南省苗族、彝族、拉祜族等民族民间珍稀药材[1]，云南多家医院主要用于治疗白血病、肿瘤、心脑血管病、黄疸型肝炎、肝肿大、跌打伤瘀肿、痛经等疾病[2]。化血胆具有可开发为治疗早期白血病、抗肿瘤和化血、溶血特效药品的潜力。长期以来，化血胆药材来源全部依赖于野生植物资源，随着天然药品市场的需求量与日俱增，化血胆野生资源受到严重破坏，目前野生资源已经很难找到[3]。由于化血胆地域分布狭窄，种子自然萌发率极低(小于0.3 %)，利用种子直播育苗困难，加之近年来掠夺式过度采挖，目前全草鲜品已经超过4000元/kg，处于有价无货，极度珍稀、濒临灭绝。因此,对其进行人工种苗快速繁殖技术研究是十分必要的。

在植物组织培养过程中，存在两种类型的污染：一类是通常所说的污染，即外植体消毒不彻底，无菌操作和培养过程中，如：培养基、接种工具、接种室消毒不严格或操作不规范而导致的污染；另一类是内生菌污染，内生菌包括真菌和细菌，本研究探讨的是内生细菌所致的污染[4-6]。在化血胆组培快繁过程中，虽然对组培前的外植体进行了严格的消毒灭菌，但10 d后发现严重的细菌污染，污染率高达60 %以上，一旦被污染，菌苔很快布满培养基表层及外植体的基部，大量消耗营养；外植体停止生长，逐渐枯萎死亡，严重影响组培苗的正常生长和继代。

内生细菌污染是普遍的，如金线莲(Anoectochilusroxburghii)组培中污染率达到50 %[7]，仙客来(Cyclamenpersicum)的块茎组织内生细菌污染率达83.0 %[8]，地黄(Rehmanniaglutinosa)由于有内生细菌的存在污染率达100 %等[9]。从已有的报道看，被鉴定的种类主要有黄单胞菌属(Xanthomonas)[10]、芽孢杆菌属(Bacillus)、萄球菌属(Staphylococcus)[11]、假单胞属(Pseudomonas)[12]、土壤杆菌属(Agrobacterium)[13]、葡肠杆菌属(Enterobacter)、棒杆状菌属(Corynebacterium) 、沙雷氏菌属(Serratia)、短小杆菌属(Curtobacterium)[14]、欧文氏菌属(Erwinia)[15-18]等。在组培苗内生菌污染防治的相关报道中，多采用对外植体进行预处理，比如：黄化处理、热击、多次消毒、灼烧、酸化培养基、在培养基中加入抗生素。特别是抗生素的使用具有较好的效果[12]。

内生菌污染是化血胆快繁体系建立的极大障碍，至今尚未有相关研究的报道。本研究通过形态特征、生理生化指标结合16S rDNA序列同源性分析，对1株引起化血胆外植体培养污染的内生细菌进行了分离与鉴定，并试验了氯霉素、链霉素、新洁尔灭、来苏尔对污染菌的防治情况，为预防化血胆组织培养污染、建立无性繁殖技术体系提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

被污染的化血胆组培苗由昆明学院农学院植物组织培养实验中心提供。

1.2 培养基

内生细菌分离和培养用NA培养基，液体培养用LB培养基，细菌DNA提取，16S rDNA片段扩增所用的各种酶、Marker、dNTPs、Buffer等试剂为宝生物工程(大连)产品，其余试剂均为国产分析纯，氯霉素(USP Grade)、链霉素(USP Grade)购自北京索莱宝生物科技有限公司，新洁尔灭、来苏尔购自济南光辉化工有限公司。

1.3 细菌的分离纯化及保藏

挑取污染菌苔接种于NA培养基上进行划线纯化，挑取单菌落于试管斜面中4 ℃保存。

1.4 形态特征观察及生理生化指标的测定

参照文献[19]进行芽孢染色后在光学显微镜下观察并拍照。形态特征观察及生理生化试验参见《常见细菌系统鉴定手册》[20]，主要测定项目包括培养性状、菌体大小、革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色、鞭毛染色、接触酶反应、运动性、氧化细胞直径、芽孢形状、葡萄糖产酸、运动性、是否好氧、V-P反应、接触酶反应、还原硝酸盐、水解淀粉、耐1 %～7 %氯化钠、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、形成吲哚、丙酸盐利用、分解酪素、分解酪氨酸、尿酶试验、5～60 ℃生长的情况，最适生长温度，最适pH。

1.5 16S rDNA序列分析

用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0提取细菌基因组DNA，方法参见试剂盒说明书。PCR反应体系(50 μl)组成：10×PCR缓冲液5 μl，dNTPs (10 mmol/L) 4 μl，引物F27/R1492[21](10 μmol/L) 2 μl，模板DNA (约50 g/L) 1 μl，Taq酶2.5 U，双蒸水35.5 μl。PCR扩增按Sambrook方法进行[22]。扩增产物经TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0回收后，送上海桑尼生物科技有限公司进行序列测定。将测得的16S rDNA全序列用EzTaxon Server version 2.1(http://www.ezbiocloud.net/)进行同源性搜索[23]，通过MEGA4.0进行比对，随后选用Maximum Composite Likelihood距离模型进行UPGMA分析生成系统发育树，发育树用Bootstrap法(1000次重复)检验。用MegAlign软件，将这些序列用Clustal W法进行多序列比对，建立系统发育进化距离图。

1.6 抑菌试验

选取氯霉素(USP Grade)、庆大霉素(USP Grade)、新洁尔灭、来苏尔，采用滤纸片法对HXD5进行抑菌试验。氯霉素和链霉素设3个梯度：0.005、0.025、0.125 g/mL，洁尔灭和来苏尔不稀释直接使用。将各抑菌平皿(直径20 cm)置于28 ℃培养48 h后，记录抑菌圈大小。

2 结果与分析

2.1 形态特征观察及生理生化指标的测定

菌株HXD5(图1b)在NA培养基上呈乳白色不透明菌落，菌落不规则形，稍凸起，表面干燥有褶皱，边缘不整齐；芽孢直杆状(图2)，约2 μm，以成对或链状排列，具圆端。依据常见细菌鉴定手册，生理生化指标均与枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtilis)特征相同(表1)。

a.被菌株HXD5污染的化血胆组培苗；b.HXD5在NA培养基上的菌落形态a.Melasma arvense’s cultivation seedling polluted by the strain HXD5; b.Colony morphologies of strain HXD5 on NA culture medium图1 菌株HXD5的形态特征Fig.1 The morphology of strain HXD5

表1 HXD5生理生化指标

图2 HXD5的芽孢染色(放大1000×)Fig.2 Spore morphologies of strain HXD5 under light microscopy (magnification, 1000×)

2.2 16S rDNA序列分析

通过BankIt (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/WebSub/?tool=genbank)将本研究所得序列HXD5提交到Genbank数据库中，登录号为KP900947。将菌株HXD5的16S rDNA与从GenBank中获取与该菌株序列同源性较高的部分菌株(表2)16S rDNA序列构建系统发育树(图3)，表明该菌株与B.subtilis、B.licheniformis、B.vallismortis、B.amyloliquefaciens聚在同一分支。通过Megalign进行同源性比对发现(图4)，HXD5与B.licheniformis、B.vallismortis同源性最高，达100 %，其次为B.amyloliquefaciens(99.9 %)、B.subtilis(99.9 %)；系统发育树与系统发育进化距离表得出的结果一致。结合2.1生理生化指标结果，将HXD5鉴定为B.subtilis。

表2 用于构建系统发育树的菌株相关信息

括号中的序号为Genbank登录号；分支上的数字为自展值百分比；线段0.005为核酸替换率Genbank accession numbers were showed in the parentheses. The number at each branch point was the percentage supported by bootstrap. Bar: 0.0005 subsitutions per nucleotide position图3 基于16S rDNA序列的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

图4 系统发育进化距离Fig.4 Sequence distance of HXD5 based on 16S rDNA full-length sequence

2.3 抑菌试验

抑菌圈直径由大到小为：氯霉素≥链霉素≥新洁尔灭≥来苏尔。浸过来苏尔的滤纸片，仅周围1 mm左右范围内无菌生长(图5)，未形成抑菌圈，几乎无抑菌效果；浸泡过新洁尔灭的滤纸片，形成了17 mm的抑菌圈直径，但抑菌圈边缘模糊，抑菌效果较弱；氯霉素、链霉素均有明显抑制HXD5的效果，抑菌圈边缘清晰，且氯霉素优于链霉素，抑菌圈直径见表3～4。

培养皿直径20 cm，a.新洁尔灭，b.来苏尔，c.氯霉素，d.链霉素The diameter of culture dish was 20 centimeters, a.Bromogeramine, b.Lysol, c.Chloramphenicol Ⅲ, d.Streptomycin Ⅲ图5 不同抗生素和消毒剂对HXD5的抑菌试验Fig.5 Bacteriostasis experiment of different antibiotics and disinfectants on HXD5

3 讨 论

Leifert[24]等研究表明，在初代培养中，表面细菌引起的污染通常在2～3 d就能在外植体周围的培养基表面形成明显的水污状、油污状、气泡或干缩的红、黄、乳白等颜色的菌落；而在外植体培养后3～5 d后才出现的细菌菌落，则可能是由内生细菌引起的污染。本研究在对化血胆组培苗污染情况调查时，发现在外植体培养后3～5 d没有细菌污染，而是在10 d后才出现的污染，所以推测可能是内生细菌引起的污染。

在组培内生菌污染防治的研究中，在培养基中加入抗生素的方法已有报道。Reed等[25]在天竺葵(Pelargoniumhortorum)组培中发现头孢噻肟(Cefotaxime Sodium)的抑菌效果良好，且对芽的增殖有促进作用。韩美丽[26]等在绿巨人(Spathiphyllumkochii)组培中研究了青霉素钠、先锋霉素和庆大霉素对继代培养中细菌污染的抑制效果，结果表明，先锋霉素的抑菌效果最好，青霉素钠和庆大霉素次之。本研究中16S rDNA序列分析和生理生化鉴定表明引起化血胆组培苗污染的细菌是B.subtilis，抑菌试验表明，无论是用氯霉素还是链霉素，使用浓度越高，抑菌效果越好，但成本也就越高。其是否会对外植体的生长造成影响还需进一步研究，此外还需要对抗生素的稳定性进行研究，应选择稳定、耐高温高压的抗生素。

表3 氯霉素抑菌结果

表4 链霉素抑菌结果

从系统发育树(图3)来看，HXD5与B.subtilis、B.licheniformis、B.vallismortis、B.amyloliquefaciens聚在同一系统发育分支，表明采用分子生物方法无法将其鉴定到种，结合生理生化指标结果，才将HXD5鉴定为B.subtilis。由此可见，基于16S rDNA序列分析的系统发育学研究有一定的局限性，16S rDNA序列同源性更适用于属以上分类单元，对于属以下分类单元分辨率明显低。在某些近缘种的鉴定中，如芽孢杆菌属中解淀粉芽孢杆菌近缘种，很难精确确定它们的分类地位。因此只有有效地将细菌经典分类学和现代分子分类学进行结合，将表型鉴定和分子生物学鉴定综合分析才能得出更为可靠的结论。

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(责任编辑 王家银)

Isolation, Identification and Control of Pollution Endophytic Bacteria during Tissue Culture ofMelasmaarvense

ZHAO Feng1, GENG Kai-you1*, HU Yi2, XIA Ti-yuan2, CHEN Ze-bin2, REN Zhen2, JIN Song2

(1.Scientific Research Department, Kunming University, Yunnan Kunming 650214, China; 2.Agriculture College of Kunming University, Yunnan Kunming 650214, China)

Using the NA culture medium to isolate the strain, the bacterial species were identified by morphology, physiological and biochemical and the sequence analysis of the 16S rDNA. The results from physiological and biochemical tests showed that the morphological characteristics of the strain HXD5 matched the descriptions ofBacillussubtilis. The sequence analysis of 16S rDNA indicated that this strain had the same embranchment with theB.amyloliquefaciens(HQ727971),B.vallismortis(FJ386541),B.licheniformis(EF644414),B.subtilis(AY583216) in the phylogenetic tree with the homology of 99.9 %-100 %. The HXD5 strain was identified asBacillussubtilis. The tests of bacterial inhibition in vitro showed that the chloromycetin had stronger antimicrobial effect than streptomycin.

Melasmaarvense; Tissue culture; Endophytic bacteria; Isolation; Identification; Control

1001-4829(2016)07-1707-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.07.037

2014-09-21

国家自然科学基金项目(31460491)；云南省科技厅应用基础研究计划青年项目(2013FD040)；云南省教育厅科学研究项目(2014Y390)；昆明学院人才引进项目(YJL14005)；云南省高校优势特色重点学科(生态学)建设项目资助(05000511311)；滇池流域农业面源污染综合防控对策研究(2016JC01)

赵 凤(1973-)，女，云南昆明人，副教授，主要从事园林植物组织培养及栽培管理研究,E-mail: lmz8226647@sina.com，*为通讯作者，E-mail: 1071889543@qq.com。

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