新疆维吾尔族宫颈癌患者人乳头瘤病毒感染与外周血中Th17细胞水平的相关性研究

张园，冯阳春，黄艳春

(新疆医科大学附属肿瘤医院 1.肿瘤防治研究所，2.检验科，新疆 乌鲁木齐 830011)



·论 著·

新疆维吾尔族宫颈癌患者人乳头瘤病毒感染与外周血中Th17细胞水平的相关性研究

张园1，冯阳春2，黄艳春2

(新疆医科大学附属肿瘤医院 1.肿瘤防治研究所，2.检验科，新疆 乌鲁木齐 830011)

目的:检测新疆维吾尔族宫颈癌患者人乳头瘤病毒(HPV)感染状况及外周血中Th17细胞比例，探讨HPV感染与Th17细胞表达的关系。方法:采用二代杂交捕获法及流式细胞术分别检测宫颈癌组(维吾尔族50例)、正常对照组(维吾尔族50例)的HPV感染状况和外周血中Th17细胞比例。结果:维吾尔族宫颈癌组HPV检出率96.0%，正常对照组HPV检出率为6.0%，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)；不同期别的宫颈癌的HPV病毒载量差异有统计学意义(P<0.05)，且随宫颈癌的FIGO分期期别越高，HPV病毒载量越高。维吾尔族宫颈癌组患者外周血Th17细胞占淋巴细胞的比例较正常对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。Th17细胞水平在HPV阳性与阴性组之间比较，差异有统计学意义(P<0.05)，并且随HPV载量的升高，Th17细胞表达水平也升高，两者呈正相关(r=0.55，P<0.001)；外周血Th17细胞表达水平与FIGO分期、是否有淋巴结转移、脉管浸润均呈正相关(r值分别为0.75、0.59、0.62，均P<0.001)。结论:Th17细胞在HPV持续感染所致宫颈癌的发生发展中可能起着重要作用。

宫颈癌；Th17细胞；人乳头瘤病毒；维吾尔族

宫颈癌(cervical cancer)是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，而在新疆地区维吾尔族宫颈癌发病率显著高于该地区其他民族[1]。超过90%的宫颈癌患者人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)检测均为阳性。在HPV病毒持续感染及其他多种因素的协同作用下，宫颈鳞状上皮细胞的免疫机制遭到破坏。因此，宫颈癌患者体内免疫微环境的变化在疾病的发生发展过程中起了重要的作用[2]。Th17(T helper 17)细胞是一种能特异性地产生IL-17(interleukin 17，IL-17)的新型CD4+T细胞。Th17细胞在对抗恶性肿瘤、自身免疫性疾病和移植物抗宿主等疾病中起到保护性免疫应答作用，且IL-17的水平与多种疾病预后和转归相关[3-4]。

本实验旨在通过研究新疆维吾尔族宫颈癌患者HPV感染状况及外周血Th17细胞表达水平，探讨两者的关系及其在宫颈癌发生、发展中的作用和意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象

宫颈癌组：2014年1月至12月于新疆医科大学附属肿瘤医院妇科住院的维吾尔族宫颈癌患者50例，所有患者术前均未经化疗、放射或生物治疗，均有明确病理分型及临床分期(FIGO)。术前无菌采集外周血3 ml加肝素抗凝；根据宫颈癌FIGO分期将患者分为Ⅰ期患者11例，Ⅱ期患者14例，Ⅲ期患者15例，Ⅳ期患者10例。

对照组：选取维吾尔族健康体检者50例作为对照，对照组年龄与宫颈癌组匹配。所有研究对象均无自身免疫性疾病史，无传染病史以及其他种类恶性肿瘤。

1.2 主要试剂和设备

采用HC2-HPV-DNA基因杂交信号放大系统检测HPV，仪器及试剂均为美国Digene公司产品；流式细胞仪FC500，美国Beckman Coulter公司产品；抗IL-17A-PE/Cy7，美国BioLegend产品；抗CD4-PC5，美国Beckman Coulter产品；Leukocyte Activation Cocktail，美国BD公司产品；固定破膜剂试剂盒，eBioscience公司产品；RPMI-1640培养基，Gibco产品；小牛血清，杭州四季青生物公司产品。

1.3 方法

1.3.1 HPV检测 使用专用的HPV采样刷置于宫颈口鳞、柱状上皮交界处采集标本。利用基因杂交、化学发光、信号放大的原理，在分子水平上检测被WHO确认的13种高危型HPV(HR-HPV)病毒DNA。标本检测结果以光量读数与标准阳性测定值比值(RLU/PC)报告，以试剂盒内附的参考值为判断标准，即RLU/PC>1时，高危型HPV阳性，反之则为阴性，RLU/PC数值越高表示标本所含病毒载量越高。将HR-HPV病毒载量分为4组，低载量1～<10；中低载量10～<100；中高载量100～<1 000；高载量≥1 000。

1.3.2 采用流式细胞术检测外周血Th17细胞水平 在无菌试管中加入200μl肝素钠抗凝全血，再加入等量1 640培养基(含小牛血清)混匀，加入2μl白细胞活化混合物(leukocyte activation cocktail)，37℃、体积分数5% CO2刺激培养4～6 h(每隔2 h混匀1次)，加入10μl CD4-PC5及同型对照进行细胞表面分子染色，加入溶血素500μl混匀室温避光10min，PBS洗涤弃上清，经固定和破膜后加入20μl IL-17-PC7抗体及同型对照进行胞内抗体染色，室温孵育30 min，加入500μl PBS重悬细胞，上机检测。Th17细胞水平以CD4+IL-17+表示。

1.4 统计学处理

应用SPSS 18.0进行统计学处理，计量资料用均数±标准差表示，多组组间比较采用方差分析，两两比较采用t检验，对宫颈癌组中不同期别的HPV DNA病毒载量均数行Kruskal-Wallis检验，相关系数采用Spearman分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HPV检出率的比较

正常对照组50例，HPV阳性3例，HPV感染阳性率为6.0%(3/50)；宫颈癌组50例，HPV阳性48例，HPV感染阳性率为96.0%(48/50)。两组HPV检出率差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 HPV病毒载量与宫颈病变分期的关系

宫颈癌患者中HPV DNA病毒载量均数在Ⅰ期组中为302.09，Ⅱ期组中为424.22，Ⅲ期组中为619.67，Ⅳ期组中为704.12，对宫颈癌组中不同期别的HPV DNA病毒载量均数进行秩和检验，不同期别的宫颈癌的HPV病毒载量差异有统计学意义(Hc=7.99，P<0.05)，且随宫颈癌的FIGO分期期别越高，HPV病毒载量越高。宫颈癌的FIGO分期期别越高，HPV病毒在较高的载量范围所占百分比越高，HPV DNA病毒载量在宫颈癌Ⅰ期组中有36.4%在中高度载量以上，在宫颈癌Ⅱ期组中有50%在中高度载量以上，在宫颈癌Ⅲ期组有73.3%在中高度载量以上，Ⅳ期组有80%在中高度载量以上。见表1。

表1 不同期别的宫颈癌的HPV病毒载量分布情况 例

Tab 1 Distribution of HPV viral load in different stage cervical cancer cases

注：括号内为所占百分比

2.3 两组外周血中Th17细胞水平比较

50例宫颈癌患者外周血Th17细胞水平为(2.05±0.48)%，50例正常对照者外周血Th17水平为(0.90±0.28)%；宫颈癌组外周血Th17细胞水平明显高于正常对照组，两组间差异具有统计学意义(t=14.49，P<0.001)。见图1。

2.4 宫颈癌病理学特征与外周血中Th17细胞水平间的关系

宫颈癌患者外周血中Th17细胞水平与FIGO分期、HPV病毒感染载量高低及是否有淋巴结转移、脉管浸润有关(均P<0.001)。宫颈癌患者外周血Th17细胞水平与FIGO分期呈正相关(r=0.75，P<0.001)；与HPV病毒载量呈正相关(r=0.55，P<0.001)，有淋巴结转移组及有脉管浸润组Th17细胞表达水平显著高于无淋巴结转移组及无脉管浸润组，差异有统计学意义(P<0.001)，外周血Th17细胞水平与是否有淋巴结转移、脉管浸润呈正相关(r值为0.59、0.62，P<0.001)。见表2。

2.5 HPV阴性与阳性者外周血中Th17细胞水平比较

HPV阳性组(正常对照组中HPV感染3例，宫颈癌组中HPV感染48例)外周血Th17细胞水平为(2.02±0.51)%，HPV阴性组外周血Th17水平为(0.90±0.29)%，两组间差异具有统计学意义(t=13.43,P<0.001)。

3 讨 论

新疆是我国宫颈癌高发区，尤其在南疆宫颈癌是当地维吾尔族妇女疾病死亡的主要原因之一。高危型人乳头瘤病毒感染是宫颈癌及癌前病变发生的重要危险因素之一。本研究结果显示，宫颈癌组HPV检出率明显高于正常对照组，不同期别的宫颈癌患者HPV病毒载量差异有统计学意义，随宫颈癌的FIGO分期期别的增高，HPV病毒载量也随之升高，且宫颈癌患者HPV病毒载量普遍在中高度载量范围，进一步证实了高危HPV感染在新疆维吾尔族妇女宫颈癌的发生发展过程中起着不可忽视的作用。

图1 两组淋巴细胞比率和Th17细胞比率比较

Fig 1 Percentages of lymphocytes and Th17 cells in two groups

宫颈癌的发生是一个多因素、多阶段、多步骤的过程，在HPV病毒持续感染及多种因素的共同作用下，宫颈鳞状上皮细胞受到破坏，并诱导机体免疫调节平衡失调，宿主自身的免疫因素对疾病的发生发展起着决定性的作用。Th17细胞是辅助性T细胞新亚群，因能够分泌白介素17(interleukin 17，IL-17)而得名，在自身免疫性疾病及机体防御反应中起到重要作用。目前在多种肿瘤，如胃癌、乳腺癌、卵巢癌、大肠癌、肾癌、非小细胞肺癌等[5-7]中发现Th17细胞及其分泌的细胞因子表达，但Th17细胞在肿瘤免疫中发挥的作用是抗肿瘤，还是促进肿瘤发展，目前仍然结论不一。

本研究中维吾尔族宫颈癌患者外周血中Th17细胞水平显著高于维吾尔族健康对照组。外周血Th17细胞水平与宫颈癌FIGO分期、淋巴结转移、脉管浸润有关，随临床分期加重而表达升高。提示Th17细胞的表达随着宫颈癌恶性程度增加而升高，在宫颈癌发生发展过程中表现为促进肿瘤生长的作用。Th17细胞可能是通过与效应性细胞相互作用、诱导机体发生肿瘤免疫监视逃逸及促进肿瘤血管上皮细胞生成等机制参与肿瘤的发生发展。Numasaki等[8]研究发现，通过转染IL-17至非小细胞肺癌肿瘤细胞中，并将此细胞种植到SCID小鼠体内，结果发现IL-17选择性增强血管生成趋化因子的分泌，促进肿瘤血管分布，加速肿瘤的生长、浸润及转移。此外，有研究发现IL-17通过改变肿瘤细胞的行为和诱发肿瘤发生的中性粒细胞招募促进乳腺肿瘤进展[9]。结肠癌、乳腺癌等多种肿瘤的研究结果[9-10]显示，Th17细胞和IL-17表达水平与患者的预后有关，Th17细胞水平的升高导致患者死亡率升高、生存期缩短、疾病预后较差。

在丙型肝炎病毒感染后的病毒清除过程中特异性Th17细胞发挥了一定作用[11]。关于Th17细胞水平与宫颈癌发生发展关系的研究并不多见，而从Th17细胞水平与HPV感染为研究视角，在新疆维吾尔族宫颈癌患者中研究的尚未见相关报道。本研究显示Th17细胞水平与高危型HPV之间的关系密切，Th17细胞水平HPV阳性组显著高于HPV阴性组，并且随HPV病毒载量的升高，Th17细胞水平也升高，两者呈正相关，提示Th17细胞可能参与清除HPV病毒的作用，HPV载量越高其对细胞因子的调节作用越显著，但HPV病毒如何诱导Th17细胞产生免疫应答尚待进一步研究。肿瘤免疫机制复杂，尚须扩大样本量进一步验证此实验结果在不同民族及地区宫颈癌发生发展的普遍性。

表2 宫颈癌患者外周血Th17细胞水平与临床各项指标间的关系

Tab 2 Relationship between the levels of Th17 cells in peripheral blood and clinical indicators in cervical cancer patients

临床指标nTh17细胞水平F或t值P值FIGO分期 Ⅰ111.47±0.2121.9620.000 Ⅱ142.02±0.27 Ⅲ152.14±0.29 Ⅳ102.58±0.48HPV病毒载量 低度载量31.48±0.346.3810.001 中度载量151.85±0.33 中高载量232.20±0.33 高度载量72.42±0.70分化程度 高分化131.86±0.41 中分化182.03±0.40 低分化192.20±0.562.0780.136淋巴结转移 有242.32±0.484.5350.000 无261.80±0.32脉管浸润 有242.33±0.464.9630.000 无261.78±0.31

[1] GUZHALINUER A，CHEN J X，MICK R.HPV spectroscopy study of Xinjiang Uygur cancer women[J].Tumor，2007，27：379-382．

[2] 钱德英，岑坚敏，王丁.高危型人乳头瘤病毒DNA检测与细胞学联合检查对子宫颈癌前病变筛查的研究[J].中华妇产科杂志，2006，41(1):34-37．

[3] AFZALI B，LOMBARDI G，LECHLER R I，et al.The role of T helper 17( Th17) and regulatory T cells( Treg) in human organ transplantation and autoimmune disease[J].Clin Exp Immunol，2007，148(1):32-46．

[4] ZHANG B，RONG Q，WEI H，et a1.The prevalence of Th 17 cells in patients with gastric cancer[J].Biochem Biophys Res Commun,2008，374(3)：533-537．

[5] KRYCZEK I，WEI S，ZOU L，et al.Cutting edge:TH17 and regulatory T cell dynamics and the regulation by IL-2 in the tumor microenvironment[J].J Immunol，2007，178(11):6730-6733．

[6] LE G，BASTUJI G，ALOULOU N，et al.High prevalence of Foxp3 and IL17 in MMR-proficient colorectal carcinomas[J].Gut，2008，57(6):772-779．

[7] ZHU X，MULCAHY L A，MOHAMMED R A，et al.IL-17 expression by breast-cancer-associated macrophages:IL-17 promotes invasiveness of breast cancer cell lines[J].Breast Cancer Res，2008，10(6):R95．

[8] NUMASAKI M，WATANABE M，SUZUKI T，et al.IL 17 enhances the net angiogenic activity andinvivogrowth of human non small cell lung cancer in SCID mice through promoting CXCR-2-dependent angiogenesis[J].J Immunol，2005，175(9):6177-6189．

[9] BENEVIDES L，TIEZZI D G，DONATE P B，et al.IL17 promotes mammary tumor progression by changing the behavior of tumor cells and eliciting tumorigenic neutrophils recruitment[J].Cancer Res，2015，75(18):3788-3799．

[10]YOSHIDA N，KINUGASA T，MIYOSHI H，et al.A High RORγT/CD3 ratio is a strong prognostic factor for postoperative survival in advanced colorectal cancer:analysis of helper T cell lymphocytes(Th1，Th2，Th17 and regulatory T cells)[J].Ann Surg Oncol，2016，23(3):919-927．

[11] ROWAN A G，FLETCHER J M，RYAN E J，et al.Hepatitis C virus-specific Th17 cells are suppressed by virus-induced TGF-beta[J].J Immunol，2008，181(7):4485-4494．

Correlation analysis of high-risk human papilloma virus viral load and the level of Th17 cells in peripheral blood in Uygur women with cervical cancer

ZHANG Yuan1，FENG Yang-chun2，HUANG Yan-chun2

(1.InstituteofTumorResearch，2.ClinicalLaboratoryDepartment，TumorHospitalAffiliatedtoXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011，China)

Objective： To investigate the correlation between human papilloma virus(HPV) and Th17 cells in peripheral blood of Uygur patients with cervical cancer.Methods: Peripheral blood was collected from 50 cases of Uygur cervical cancer patients and 50 Uygur healthy people.Hybrid capture Ⅱ method was used to detect viral load of HPV.The percentage of Th17 cells was detected by flow cytometric analysis.Results: The rate of HR-HPV infection was 96.0% in the cervical cancer group，6.0% in healthy control group(P<0.05).The percentages of Th17 cells in cervical cancer group was significantly higher than that in the healthy control group(P<0.05).The percentages of Th17 cells between HPV positive and negative group was statistically significantly different(P<0.05).The expression of Th17 cells in peripheral blood was positively correlated with FIGO stage，lymph node metastasis，and vascular infiltration(r=0.55，0.59，0.62，P<0.001).Conclusion: Th17 cells may play an important role in the development of persistent HPV infection leading to cervical cancer．

cervical cancer；Th17 cell；human papilloma virus；Uygur

2016-03-02

2016-05-26

新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目(2015211C133)；新疆医科大学附属肿瘤医院科研启动基金资助项目(肿2014-04)

张园(1982-)，女，河北保定人，助理研究员。E-mail:xj_zhangyuan@163.com

黄艳春 E-mail:huangyanchun0619@sohu.com

张园，冯阳春，黄艳春.新疆维吾尔族宫颈癌患者人乳头瘤病毒感染与外周血中Th17细胞水平的相关性研究[J].东南大学学报：医学版，2016，35(5)：699-703.

R737.33

A

1671-6264(2016)05-0699-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2016.05．011