宋 渊,方鹏飞
1甘肃省中医院,甘肃 兰州 730050;2甘肃省中医院白银分院
血塞通对家兔皮瓣移植术后并发症的早期干预及对VEGF、bFGF表达的影响*
宋 渊1,方鹏飞2
1甘肃省中医院,甘肃 兰州 730050;2甘肃省中医院白银分院
目的:研究血塞通对家兔皮瓣移植术后并发症早期的影响,并观察其对血清血管内皮细胞生长因子(V EG F)、碱性生成纤维细胞生长因子(bFG F)表达的影响。方法:健康新西兰兔60只随机分为血塞通组、甘露醇组、生理盐水组、假手术组,造腹部皮瓣移植术模型,取皮瓣近、中、远端标本进行H E染色,并检测术后第1小时、第24小时、第7天共3个时相标本超氧化物歧化酶(SO D)、髓过氧化物酶(M PO)含量,ELISA法检测血清V EG F、bFG F表达情况。结果:1)血塞通组皮瓣坏死面积较小,镜下炎性水肿较轻。标本SO D、M PO值与生理盐水组比较,具有统计学意义(P<0.01)。2)术后血清V EG F、bFG F值均高于生理盐水组,具有统计学意义(P<0.01)。结论:血塞通能减轻皮瓣移植术后水肿,改善静脉淤血,降低皮瓣移植术后早期并发症发生率。
血塞通;皮瓣移植;早期并发症;缺血再灌注;超氧化物歧化酶;髓过氧化物酶;血管内皮细胞生长因子;碱性成纤维细胞生长因子
皮瓣移植术后早期通常会形成水肿(Edema)和静脉淤血(Venous congestion)等并发症。水肿与静脉淤血又互为因果,静脉受压使管腔狭窄或血栓闭塞,血液回流受阻导致相应组织器官发生淤血,导致皮瓣坏死,称为皮瓣的静脉危象(The flap Venous crisis)。缺血再灌注(Ischemiareperfusion injury,I-R)损伤又会产生大量的超氧自由基(ROS),与体内的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化等一系列损伤,产生更为严重的损伤。而再灌注时超氧化物歧化酶(SOD)、髓过氧化物酶(MPO)可以反映皮瓣组织内氧代谢的情况,同时可以侧面反映出组织代谢、细胞损伤及其凋亡的情况。血管内皮细胞生长因子(VEGF)是皮瓣再血管化的重要影响因子,重建皮瓣移植术后的血液循环,可提高再生血管数量,从而使皮瓣微循环得到改善[1]。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是一种多功能细胞生长因子,能够高效促进血管内皮细胞、成纤维细胞和血管平滑肌细胞生长,对新生毛细血管的形成具有强烈促进作用[2]。新近的一些研究发现血塞通具有抗组织缺血再灌注损伤的作用。为此,我们采用具有较好血管活性作用的血塞通,通过给已造成腹部静脉淤血皮瓣模型的家兔静脉注射,观察皮瓣愈合情况,检测皮瓣标本组织中的SOD、MPO活性值,及血清VEGF、bFGF表达的变化情况,探讨其治疗皮瓣移植术后早期并发症的机制。
1.1 动物 成年新西兰长耳白兔健康清洁级60只,体质量2.0~2.5 kg,雌雄不限,雌兔未孕,由兰州生物制品研究所动物实验中心提供,动物质量合格证号SCXK(甘)2012-0001。
1.2 试剂 实验试剂超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、髓过氧化物酶(MPO)试剂盒、考马斯亮兰蛋白测试盒均购自南京建成生物工程研究所。Rbbit VEGF试剂盒、Rbbit bFGF试剂盒购自美国R.D公司。实验用药血塞通冻干粉(广西梧州制药集团公司生产,国药准字Z20025652),主要成分三七总皂苷,PNS,100 mg/支。
1.3 方法
1.3.1 实验分组 用随机数字表法将60只家兔按体质量编号,随机分为4组,每组15只。A组,即实验组(血塞通静脉注射);B组,即对照组(20%甘露醇静脉注射);C组,即空白组(生理盐水静脉注射)。以上3组每只大白兔可造腹部淤血皮瓣模型2个,共90个皮瓣模型,其中取材皮瓣24个;D组,即假手术组(兔腹部手术切口,不做皮瓣,原位缝合,不用药)只检测手术前后血清因子。以上各组分别在造模前和造模后第7天心脏采血,造模后给予定期换药,继续喂养,观察皮瓣愈合情况。
1.3.2 动物模型制作 术前术区备皮,用8%硫化钠溶液进行腹部脱毛,脱毛需暴露整个腹部,术前称体质量,戊巴比妥钠粉剂按比例配制成3%的溶液,按2 mL/kg肌肉注射麻醉。取仰卧位,碘伏消毒,铺一次性无菌手术巾,以腹壁下动脉及浅静脉为中轴,标记笔划出长宽比例为12∶4 cm的皮瓣,皮瓣蒂部设计在兔下腹部。沿标记线切开皮肤,深达肉膜层,勿伤及深层肌肉,形成一U形皮瓣,掀起皮瓣至蒂部,游离腹壁下静脉及髂腹股沟静脉,结扎静脉后剪断,造成静脉淤血模型,将皮瓣复位,直接原位缝合皮肤和肉膜,注意伤口缝线保持一定松紧度,防止缺血性坏死,伤口无菌纱布包扎。
1.3.3 给药剂量及方法 根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”确定给药量。A组将血塞通粉剂与生理盐水按2∶1配制成200%溶液,造模后按照50 mg/kg剂量耳缘静脉注射,1次/d,连续5天;B组造模后给予20%甘露醇注射液,按照18 mL/kg剂量静脉注射,1次/d,连续5天;C组造模后给予0.9%生理盐水,按照18 mL/kg剂量静脉注射,1次/d,连续5天;D组造兔腹部手术切口,不做皮瓣,原位缝合,不用药。
1.3.4 标本取材 造模前心脏采血5 mL,离心取血清保存于-80℃冰箱中。在术后第7天,切取皮瓣近、中、远段区域皮肤组织块作为标本,置入10%甲醛溶液中固定,并切制成病理切片。分别于术后1小时、24小时、7天共3个时相,切取皮瓣近、中、远段区域皮肤组织块作为标本,放于-80℃冰箱或液氮罐中保存,可制成10%的组织匀浆液,随时检测SOD、MPO活性。造模后第7天再次采血,方法及保存同造模前。
1.3.5 观察指标
1.3.5.1 大体观察 术后观察动物皮瓣愈合的大体情况,包括皮瓣有无肿胀、质地、颜色、有无炎性渗出等。
1.3.5.2 皮瓣坏死率测定 术后皮瓣照相,照片用Photoshop软件进行像素法分析皮瓣坏死区域范围。
坏死率(%)=(总面积-成活面积)/总面积×100%
1.3.5.3 组织切片标本HE染色、光镜观察 对组织切片标本进行HE染色、光镜下观察。
1.3.5.4 皮瓣组织中SOD、MPO的测定 1)蛋白含量的检测:考马斯亮兰法检测组织蛋白含量,按照南京建成生物公司的试剂盒步骤,逐项进行操作,具体过程略。2)SOD的检测:试剂的组成与配制,按照南京建成生物公司的试剂盒步骤,逐项进行操作,具体过程略。3)MPO的检测:测定原理:中性粒细胞中储存有髓过氧化物酶,且所含的酶的量是有一定比例的,MPO在中性粒细胞中有很高的活性,其活性常用作活化中粒细胞浸润皮肤程度的一个指标。按照南京建成生物公司的试剂盒步骤,逐项进行操作,具体过程略。计算公式:
MPO(U/g)=(测定管的吸光度值-对照管的吸光度值)/11.3×取样量(g)
1.3.5.5 酶联免疫吸附法(ELISA)血清VEGF及bFGF的检测 血清VEGF及bFGF检测按照试剂盒使用说明书进行操作。ELISA法结果计算:以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,计算出标准曲线回归方程式,由计算机软件处理数据。
1.4 统计学方法 数据使用SPSS 18.0统计软件进行统计处理,计量资料以(s)表示,检测实验数据在符合正态分布及方差齐性的情况下,采用单因素方差分析(ANOVA),不符合正态分布采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 皮瓣大体观察 4组家兔均无死亡病例,有3例出现单侧皮瓣术后感染,经青霉素注射及换药治疗后伤口好转。术后1小时,3组家兔皮瓣远端呈现暗红色,略显苍白,水肿明显,各组差别不大。术后24小时,3组家兔皮瓣远端均出现坏死黑痂,尤以C组为多,约占总皮瓣面积的1/3,C组中端皮肤肿胀,淤血明显,色泽晦暗,近端皮肤暗红色;A组、B组中端皮肤轻度肿胀,色泽变暗;近端皮肤接近正常。术后第7天,3组皮瓣坏死区域干燥结痂,呈黑色,与周围皮肤界限清楚。C组远端及部分中端痂壳较硬,切割组织无新鲜出血。A组、B组中端皮肤呈暗红色,近端皮肤柔软,颜色正常,并且已有毛发生长。见图1。
图1 愈合情况
2.2 皮瓣坏死率 术后7天3组皮瓣坏死率采用单因素方差分析,发现皮瓣实验各组与对照组之间均有统计学差异(P<0.05);C组皮瓣坏死率明显高于 A、B组,差异有统计学意义(P<0.05);C组皮瓣成活率低于A、B组,差异具有统计学意义(P<0.05);A组和B组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
表1 各组皮瓣坏死面积比较(s)
表1 各组皮瓣坏死面积比较(s)
注:△表示坏死面积与C组比较,P<0.01;A组与B组比较,P>0.05。
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2.3 皮瓣组织切片H E染色、显微镜观察 实验各组家兔于术后7天取材,进行病理学观察,取近、中、远3段组织分别进行比较。
2.3.1 皮瓣近端 A组、B组无明显组织水肿,几乎少见中粒细胞浸润。可见有纤维细胞增生,皮肤附属腺体及组织内毛囊有增生;C组可见轻度组织水肿,毛细血管扩张充血,中性粒细胞浸润明显,纤维细胞明显增生,角质层无缺损,见图2。
2.3.2 皮瓣中端 A组、B组,可见组织水肿,表皮层尚完整,略有变薄,毛细血管大量增生,皮肤深层有明显血管扩张和径腔变大,管壁内有纤维母细胞大量增生,结缔组织增生,炎症细胞增多。C组可见组织明显水肿,表皮层有缺损,皮肤深层可见毛细血管内有血栓形成,轻度增生和血管扩张,毛囊内有炎细胞浸润,纤维细胞有增生,炎症细胞浸润满视野,多有坏死及结痂组织,见图3。
2.3.3 皮瓣远端 A组、B组、C组均可见大量痂壳组织。C组远端有大量碎片及空泡形成,已失去皮肤正常结构,未见有毛囊及附属腺体组织;B组远端结痂边缘中性粒细胞浸润明显;A组远端痂壳周围新生的肉芽组织。见图4。
由此可见,血塞通和甘露醇注射能减轻皮瓣术后的炎性浸润,促进血管增生,使皮下纤维结缔组织更加致密,从而使皮瓣更有活力,更接近生理状态。
图2 皮瓣近端,20×
图3 皮瓣中端,20×
图4 皮瓣远端,20×
2.4 皮瓣组织SO D、M PO的检测结果 1)术后1小时、24小时、7天3个不同的时相检测皮瓣近、中、远端组织中SOD的含量,发现SOD的水平在皮瓣组织远端处最低,其次是中端,最高在近端,组内比较差异有统计学意义(P<0.01)。从表2数据显示皮瓣远端是缺血坏死最严重的部位,测得其SOD水平低下,因此清除氧自由基的能力严重下降。组间比较,A、B组的SOD水平高于C组,差异有统计学意义(P<0.01),说明三七总皂甙可以保护组织中SOD活力,提高组织抗氧自由基的能力。见图5—7。2)分别在术后1小时、24小时、7天3个不同时相,检测皮瓣近、中、远端组织中MPO的含量,发现MPO含量在皮瓣远端处最高,其次是中端,最低在近端,组内比较差异有统计学意义(P<0.01)。从表3数据显示皮瓣远端是缺血坏死最重的部位,测得其MPO水平最高,因此组织中粒细胞浸润最明显,组织炎症严重。组间比较,A、B组的MPO水平要低于C组,差异有统计学意义(P<0.01),表现出三七总皂甙可以降低MPO水平,减轻组织炎性病变。见图8—10。
图5 与C组比较术后1h皮瓣SO D值
图6 与C组比较术后24h皮瓣SO D值
图7 与C组比较术后7d皮瓣SO D值
图8 与C组比较术后1 h皮瓣M PO值
图9 与C组比较术后24 h皮瓣M PO值
图10 与C组比较术后7 d皮瓣M PO值
2.5 术前与术后第7天血清V EG F及bFG F检测结果 各组术前与术后VEGF值比较,差异有统计学意义(P<0.01);术后VEGF值,A组与B组、C组与D组比较,差异无统计学意义(P>0.05);A组与C、D组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。说明手术创伤均能促进VEGF表现活跃,而血塞通则更能突出提高VEGF表达水平。见表2。
表2 术前与术后血清V EG F含量比较(s) ng/L
表2 术前与术后血清V EG F含量比较(s) ng/L
注:4组组内比较,P<0.01;4组术后V EG F值组间比较,△表示与C组比较,P<0.01;*表示与D组比较,P<0.01。
组别 只数 术前 术后A组 15 81.14±13.34 135.76±10.02△*B组 15 80.82±2.62 138.01±15.05△*C组 15 81.89±8.65 98.33±8.16 D组 15 82.31±9.06 99.49±10.46
2.6 bFG F值 各组术前与术后bFGF值比较,差异有统计学意义(P<0.01);术后bFGF值,A组与B组间比较,P>0.05(P=0.664),C组与D组比较,异均无统计学意义P>0.05(P=0.823);A组与C、D组比较,差异有统计学意义P<0.01(P=0.001)。见表3。
表3 术前与术后血清bFG F表达比较(s) ng/L
表3 术前与术后血清bFG F表达比较(s) ng/L
注:4组术后V EG F值组间比较,△表示与C组比较,P<0.01;*表示与D组比较,P<0.01。
组别 只数 术前 术后A组 15 9.48±0.99 17.35±3.07△*B组 15 9.49±0.79 16.13±3.20△*C组 15 9.77±0.99 12.16±0.89 D组 15 9.75±1.07 11.66±0.74
皮瓣移植静脉危象的研究比较成熟,但血塞通对皮瓣移植术后早期并发症的研究目前尚不多。本研究显示,实验组在外观形态上皮瓣坏死面积小于空白组,皮瓣坏死率分别是19.52%和30.18%。病理切片HE染色观察结果显示:血塞通组中性粒细胞浸润减少,水肿减轻,血管扩张,肉芽组织和纤维细胞增生明显,皮肤深层毛囊和附属腺体均可见增生。通过以上实验结果,我们认为血塞通改善皮瓣术后水肿及静脉淤血,促进皮瓣愈合的机理,可能与下列因素有关:
3.1 对抗缺血再灌注产生的代谢物侵袭,降低脂质过氧化损伤 缺血后再灌注过程中会产生大量活性氧物质(ROS),包括超氧阴离子、自由基和过氧化物,这些活性氧物质氧化作用很强,在局部堆积时可引发强烈的毒性反应[3]。氧自由基导致微循环障碍的主要机理,是其会形成连锁反应,并不断形成新的自由基,引起毛细血管通透性增加、血管收缩、血管内皮细胞肿胀[4]。钟琳[5]研究发现三七总皂苷(PNS)具有抗氧化应急的效果,与脑组织中SOD活性升高、ROS含量降低有相关联系。血塞通可通过减少氧化活性物产生,抑制炎症因子损害,减轻缺血再灌注损伤,保护缺血的组织细胞。本实验研究结果发现术后远端SOD含量最低、近端SOD含量最高,说明缺血的程度与SOD活性成正比,且受氧自由基的损伤程度重。A组术后3个不同时相测得近、中、远端SOD水平均高于C组,说明血塞通能够通过提高SOD活力,来有效清除超氧阴离子和自由基,减少组织中脂质过氧化物的产生,并起到保护细胞膜的作用。
3.2 减轻中性粒细胞浸润 皮瓣缺血再灌注损伤的另一重要因素是中性粒细胞大量聚集[6]。由于皮瓣组织缺血,导使细胞膜受到损伤,引起代谢产物花生四烯酸增多,吸引白细胞黏附于血管内皮,并释放白细胞介素、补体等具有趋化作用的炎性介质,加重局部炎性损伤[7]。任周新等[8]研究中对脑缺血再灌注的大鼠应用PNS,发现IL-8、ICAM-1的释放减少,中性粒细胞与血管内皮的黏附、聚集受到阻碍,使中性粒细胞在缺血脑组织中的浸润和活化受到减弱,所以保护脑组织避免受到进一步的损伤。在本试验的3个不同时相里,血塞通组MPO活性比生理盐水组均有明显降低,有显著性差异,皮瓣坏死率降低,证明PNS可以减少中性粒细胞的积聚,降低炎性介质对组织和细胞的侵袭损伤。
3.3 抗血栓形成 三七能显著抑制血小板聚集和血浆凝血。王芳等[9]通过大鼠实验研究,发现PNS及其单体Rgl、R1、Rbl能降低血栓与血管管腔面积的比例,还发现PNS及其单体可以抑制血栓形成,且其作用与阿司匹林相似。郑仁东等[10]认为血塞通能有效的防止血栓的形成,抗血小板聚集,促纤维蛋白原溶解,能积极预防动脉粥样硬化。刘丽萍[11]临床研究发现血塞通注射液(PNS)可降低胆固醇、甘油三酯,降低血液黏稠度,促进红细胞变形性,降低血浆黏度与血细胞比容。
3.4 扩张血管,增加血管形成 有研究[12]表明,血塞通能明显抑制钙离子通过受体操纵的钙通道(ROCC)和存储操作的钙离子通道(SOCC),抑制无电压依赖性内向钙电流的影响(VDCC)和血管平滑肌细胞内Ca2+释放。血塞通对细胞增殖有抑制作用和反向基底动脉重构[13],而Rb1和Rg1通过调节PI3K/Akt通路和L-精氨酸对血管内皮细胞[14]运输来促进内皮依赖性血管扩张。周家明等[15]用三七总皂苷(PNS)的单体单独给药,证明其改善心肌缺血的作用,得出的结果是皂苷单体R1可降低心肌缺血模型大鼠的CK、LDH、MDA水平;R2可降低MDA水平;Rbl可降低LDH水平;R1、R2和Rbl对SOD水平均无明显影响,初步可证明,R1和R2对大鼠心肌缺血性损伤具有一定程度的保护作用。王潇等[16]认为PNS能通过促进EV304细胞VEGF和KDR的表达,通过细胞内信号途径使PERK1/2增加,促进血管内皮细胞增殖,增加血管新生数量,参与血管生成。
虽然血塞通可以减轻动物实验皮瓣移植术后水肿和淤血,但并不能代表在人体内的真实情况,因此对本结果的解释需谨慎。由于多种因素参与了影响皮瓣手术后病理生理过程,因此有关血塞通对其影响以及与皮瓣愈合的关系尚需进一步深入系统的研究。
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Effects of XueSaiTong on Early Intervention of Complication after Rabbit Skin FlapTransplantation and VEGF and bFGF Expressions
SONG Yuan1,FANG Pengfei2
1 Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730050,China;
2 Baiyin Branch of Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine
Objective:To study the early effects of XueSaiTong on complication after rabbit skin transplantation and to observe its effects on VEGF and bFGF expressions of serum.Methods:All 60 healthy New Zealand rabbits were divided into the XueSaiTong group,the mannitol group,the saline group and the sham operation group randomly,model of abdominal skin flap transplantation was made,near,middle and distal end of skin flap were selected to be stained by HE,the level of SOD and MPO were detected at the first hour,the 24th hour and the seventh day after the operation,VEGF and bFGF expressions of serum were detected by ELISA.Results:1)Necrosis area of skin flap in the XueSaiTong group was small and inflammatory edema under scope was gentle.Compared with the saline group in SOD and MPO,there were obvious statistical differences(P<0.01).2)VEGF and bFGF of serum after operation were all higher than these of saline group,there were obvious statistical differences(P<0.01). Conclusion:XueSaiTong can relieve edema after skin flap transplantation;improve vein congestion and reduce early complication after skin flap transplantation.
XueSaiTong;skin flap transplantation;early complication;ischemia reperfusion;SOD;MPO; VEGF;bFGF
R285.5
A
1004-6852(2016)10-0011-06
2015-10-20
甘肃省自然科学研究基金项目(编号1212RJZA 086)。
宋渊(1980—),男,博士学位,副主任医师。研究方向:四肢创伤的中医药防治。