管通方醇提物对人食管癌EC9706细胞抑制作用的研究*

李建省，靳 锋，王宝蕊，张竹君，杨维建，丁文君，张新丽，徐 进

甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050

管通方醇提物对人食管癌EC9706细胞抑制作用的研究*

李建省，靳 锋，王宝蕊，张竹君，杨维建，丁文君，张新丽，徐 进

甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050

目的:通过观察管通方醇提物对食管癌EC9706细胞增殖、细胞周期的影响，揭示该方抑制食管癌EC9706生长的作用机制。方法:体外培养食管癌EC9706细胞，用管通方醇提物处理细胞，M TT法检测管通方醇提物对食管癌EC9706细胞增殖影响的量效关系；倒置显微镜下观察食管癌EC9706细胞形态学变化；PI单染标记流式细胞术检测醇提物对食管癌EC9706细胞周期的影响。结果:管通方醇提物均可不同程度地抑制食管癌EC9706细胞的增殖，其抑制率呈剂量依赖关系；管通方醇提物影响了细胞形态结构。管通方醇提物对EC9706细胞周期各时相均有影响。与对照组比较，管通方组G0/G1期细胞比率升高(P＜0.05)。结论:管通方醇提物将食管癌EC9706细胞阻滞于G0/G1，阻滞细胞周期的进程，该方对食管癌EC9706细胞的增殖具有抑制作用。

食管癌；EC9706细胞；管通方；细胞周期阻滞

食管癌是全世界最常见的六大恶性肿瘤之一，我国是世界上食管癌发病率和病死率最高的国家，食管癌居恶性肿瘤死亡第四位［1］。每年全世界新诊断的30万食管癌患者中，1/2(16.72万)以上发生在中国，并且预后极差，5年生存率仅10%左右［2-3］。因此对食管癌的防治研究是中国乃至全世界食管癌研究者的重点、难点和热点。中医药治疗食管癌具有独特的优势，笔者运用管通方治疗食管癌取得满意疗效。本研究通过研究管通方醇提物对食管癌EC9706细胞增殖及细胞周期的影响，探讨该方治疗食管癌的作用机制，为进一步研究该方提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 试剂 人食管癌细胞株EC9706购于上海中科院细胞库，RPMI Medium 1640培养基(索莱宝公司生产，批号:31800-500)、细胞周期检测试剂盒(南京凯基生物公司生产，批号:KGA512)、Tyrode液自行配制、小牛血清(杭州四季青公司生产，批号:121005)、胰蛋白酶(索莱宝公司生产，批号: T1320-100)、MTT(索莱宝公司生产，批号:T1320-100)、DMSO(Amresco)、70%乙醇、PBS自行配制。

1.2 仪器 FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司提供)、Heraeus细胞培养箱(美国Kendro公司提供)、倒置显微镜(ZEISS公司提供)、3-18K台式离心机(Sigma公司提供)、SG-603生物安全柜(Bake公司提供)。

1.3 细胞分组 以1×106cells/皿细胞密度种EC9706细胞于φ100 mm培养皿中，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养24小时后，弃上清液，设空白对照组及管通方400、800、1 600 μg/mL组，共4组，各药物组分别加入含IC50且药物浓度为10%小牛血清培养基10 mL，空白对照组加等量含10%小牛血清培养基，继续培养48小时。

1.4 管通方醇提物制备 管通方由斑蝥、旋覆花、黄芪、牛膝等组成，称取以上方95%的乙醇提取并干燥，溶解于二甲基亚砜(DMSO)，配制成浓度为300 μg/μL的药液，然后用不含血清的培养基RPMI1640，配成4 μg/μL的贮存液，-20℃冰箱保存备用。

1.5 M TT法测定管通方醇提物对EC9706细胞增殖影响的量效关系 以5×103个细胞/孔的密度接种于96孔平面培养板，含小牛血清培养液200μL/孔，于37℃，5%CO2饱和湿度的CO2培养箱培养24小时，弃上清液，加入含管通方醇提物的10%小牛血清培养基200 μL，浓度分为25、50、100、200、400、800、1 600、3 200 μg/mL8个梯度，每组设3个复孔，空白对照组加含10%小牛血清的培养基200 μL，继续培养48小时。弃上清液，每孔加100 μL含0.2 mg/mL MTT的无血清培养基，孵育4小时，弃上清液。每孔加入150 μL DMSO，振荡10分钟后用酶标仪以570 nm/630 nm测定光吸收值(OD)。实验重复3次。按照肿瘤细胞生长抑制率(%)=(1-用药组OD值/对照组OD值)×100%公式计算各药物组对肿瘤细胞增殖的抑制率。运用SPSS 13.0进行曲线拟合，并根据概率估计，求出药物半数有效量(IC50)。

1.6 细胞形态观察 以1×106cells/皿的密度接种EC9706细胞于φ100mm培养皿中，10mL/皿，于37℃，5%CO2，饱和湿度的CO2培养箱培养24小时。分别加入含管通方醇提物400、800、1600μg/mL的10%小牛血清培养基200 μL，空白对照组加含10%小牛血清的培养基200 μL，培养48小时，倒置相差显微镜下观察各组EC9706细胞形态变化，拍×200照片。

1.7 流式细胞仪测定细胞周期 加药培养48小时后，弃上清液，加入2.5 mL0.25%胰蛋白酶消化2～3分钟，2 000 r/min离心5分钟，弃上清液后加入5 mL PBS重悬细胞，计数，按照凯基细胞DNA含量检测试剂盒操作方法，收集并调整细胞浓度为1×106/mL，2 000 r/min离心5分钟，加入PBS清洗，用70%乙醇固定过夜。按细胞周期检测试剂盒操作，采用FACSCalibur流式细胞仪对各组样品进行检测，每样本获取104个细胞荧光信号，激发波长488 nm，用CellQuest Pro获取、分析软件检测EC9706细胞周期分布。周期分布用GO/G1%，S%，G2/M%表示。

1.8 统计学方法 数据运用SPSS 13.0进行统计分析，组间比较用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 管通方醇提物对EC9706细胞形态的影响 管通方醇提物1 600、800、400 μg/L处理细胞后，低浓度(400 μg/L)组与对照组比较，细胞形态变化不明显。中浓度(800 μg/L)组细胞生长较分散，细胞分裂减少，胞内充满大量颗粒状或空泡样物质，部分细胞核变小，核仁数目减少，染色质凝聚。高浓度(1 600 μg/L)组细胞增长缓慢，细胞间接触松散，细胞汇合率低，出现部分漂浮细胞，可见部分细胞膜皱缩发泡，少量细胞固缩呈圆形或卵圆形且透亮。见图1。

图1 管通方醇提物不同浓度对食管癌EC9706细胞形态影响

2.2 管通方醇提物对EC9706细胞增殖影响的量效关系 以管通方醇提物药物浓度为横坐标、抑制率为纵坐标，运用SPSS 13.0回归分析进行曲线拟合，拟合剂量-效应关系曲线，并按概率估计求出IC50值。结果显示管通方醇提物对EC9706细胞生长具有抑制作用，并呈剂量依赖性关系。8个梯度中，1 600 μg/mL浓度时，抑制率最高，提示800 μg/mL为有效药物剂量，1 600 μg/mL时发生细胞毒性作用。见表1。

表1 管通方醇提物对EC9706细胞增殖的影响

2.3 管通方醇提物对细胞周期的影响 管通方醇提物处理EC9706细胞48小时，用流式细胞仪检测各期细胞数量。随药物浓度的增加，EC9706细胞在细胞周期中的分布出现明显的变化与对照组比较，G0/G1期细胞比率逐渐增加，S期和G2/M细胞比率逐渐减少，低浓度组与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，中浓度组、高浓度组时与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 管通方醇提物对细胞周期的影响(s) %

表2 管通方醇提物对细胞周期的影响(s) %

注:△表示与对照组比较P＜0.05。

组别 G0/G1S G2/M对照组 41.85±0.56 35.41±0.32 22.27±13.10高浓度组 54.51±1.27△31.79±0.43△13.71±1.38△中浓度组 45.34±1.10△34.27±0.68△19.94±1.27△低浓度组 42.89±0.70 36.82±0.67 20.25±1.08

3 讨论

食管癌属于中医“噎膈”范畴［4-5］，中医学认为虚、痰、瘀、郁、气是噎膈的主要病因病机。现代医家以化痰瘀、消癌肿、通壅阻、降逆气治法治疗，可明显改善症状。笔者认为“肿瘤的本质是细胞水平上阴阳平衡失调，肿瘤细胞增殖失控(阳盛)，凋亡不足(阴衰)，即细胞水平上阳盛阴衰导致肿瘤发生”［6］。司富春等［7-8］对单味药物及中药复方进行实验研究，发现其可抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡，上调Fas，下调Bcl-2和激活caspase-3。

本研究通过文献分析，并结合临床研究，自拟管通方由班蝥、旋覆花、黄芪、牛膝等药物组成，具有益气活血、解毒散坚之功，治疗食管癌具有良好的效果，但抗癌作用尚不清楚，本研究对管通方醇提物进行体外研究，观察其对人食管癌EC9706细胞增殖及细胞周期的影响［9］。在此过程中细胞遗传物质复制并加倍且在分裂结束时平均分配至两个子细胞中，通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可将细胞周期各时相区分为G1/G0期、S期和G2/M期，并计算出各时相的百分比。肿瘤细胞均有其自身的生长周期特征与规律，通常情况下，细胞的G0/G1期持续时间最长，因此，G0/G1期细胞比率最高；G2/M期时间相对较短，因此，处于G2/M期细胞比率最低。

本研究显示，管通方醇提物抑制EC9706细胞的增殖，且抑制率随药物浓度增加而上升，呈剂量-效应依赖性关系，提示800 μg/mL为有效药物剂量，在1 600 μg/mL浓度时，抑制率最高，但此时可见细胞间接触松散，部分细胞膜皱缩发泡，出现细胞毒性作用。随着管通方醇提物浓度的增加，EC9706细胞周期的分布出现明显的变化，G0/G1期细胞比率逐渐增加，S期和G2/M细胞比率逐渐减少；当浓度为800、1 600 μg/mL时与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。说明管通方醇提物能将细胞阻滞在G0/G1期，但其影响细胞周期哪些因子的表达来实现其抑制食管癌细胞的增殖，目前尚不清楚，需要进一步深入研究。

［1］ 张思维，张敏，李光琳，等.2003—2007年中国食管癌发病与死亡分析［J］.中国肿瘤，2012，21(4)：241-247.

［2］ W u C，H u Z，Li n D，et al.G enom e-w i de associ at i on st udy i dent i fi es t hree new suscept i bi l i t y l ocifor esophageal squam ous-cel l carci nom a i n Chi nese popul at i ons［J］.N at G enet，2011，43(7)：679-684.

［3］ 王立东.河南食管癌研究的理解和思考［J］.郑州大学学报:医学版，2006，41(1):1-5.

［4］ 吕安林.食管癌术后中药辅助治疗42例疗效观察［J］.西部中医药，2013，26(8)：92-93.

［5］ 高振华.孙秉严治疗食管癌经验述略［J］.西部中医药，2011，24(8)：37-38.

［6］ 李建省，司富春.肿瘤细胞凋亡的中医阴阳理论阐释［J］.辽宁中医杂志，2010，3(6)：1034-1035.

［7］ 司富春，刘紫阳.食管癌中医证型和用药规律分析［J］.中医学报，2012，27(6):655-657.

［8］ 司富春.启膈散、沙参麦冬汤、通幽汤和补气运脾汤对hEG F刺激的人食管癌EC9706细胞生长信号转导的调节［J］.世界华人消化杂志，2010，18(28):2956-2965.

［9］ 杨抚华.医学细胞生物学概论［M］.成都：四川技术出版社，1996：237-254.

Study on the Inhibiting Effects of Alcohol Extract from GuanTong Formula on EC9706 Cell of Esophageal Cancer

LI Jiansheng,JIN Feng,WANG Baorui,ZHANG Zhujun,YANG Weijian,DING Wenjun,ZHANG Xinli,XU Jin
Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730050,China

Objective：To reveal the mechanism of GuanTong formula inhibiting EC9706 growth of esophageal cancer by observing the effects of alcohol extract from GuanTong formula on cell proliferation and cell cycle of EC9706.Methods：EC9706 cells of esophageal cancer were cultivated in vitro,and they were processed by alcohol extract from GuanTong formula,the dose-effect relationship between the effects of alcohol extract from GuanTong formula on EC9706 cell proliferation were detected by MTT method;the morphological changes of EC9706 cell of esophageal cell were observed under the inverted microscope;the effects of alcohol extract on EC9706 cell cycle of esophageal cancer were detected by using PI single staining flow cytometry.Results：EC9706 cell proliferation of esophageal cancer was inhibited by alcohol extract from GuanTong formula in varying degrees,its inhibiting rate was dose-effect relationship;alcohol extract from GuanTong formula influenced cell morphological structure and all stages of EC9706 cell cycle.Compared with the control group,the cell rate of G0/G1checkpoint in GuanTong formula group elevated (P＜0.05).Conclusion：Alcohol extract from GuanTong formula arrests EC9706 cell of esophageal cancer in G0/G1and induces cell differentiation,this formula has the function of inhibiting EC9706 cell proliferation of esophageal cancer.

esophageal cancer;EC9706 cell;GuanTong formula;cell cycle arrest

R735.1

A

1004-6852(2016)10-0008-03

2016-01-06

甘肃省自然科学基金项目(编号1308RJZA 250，1308RJZA 164)；甘肃省高等学校科研项目(编号2013A-082)。

李建省(1976—)，男，博士学位，副主任医师。研究方向:慢性肾脏疾病的中医药防治及临床与实验研究。