强痛宁对大鼠中枢脑区NO/cGMP信号转导通路影响

尹柏双 ， 宋永利 ， 呼显生 ， 沙万里 ， 石星星 ， 高 利 ， 付连军

(1.吉林农业科技学院动物医学学院 ， 吉林吉林132101；2.东北农业大学动物医学学院 ， 黑龙江哈尔滨150030)



强痛宁对大鼠中枢脑区NO/cGMP信号转导通路影响

尹柏双1， 宋永利1， 呼显生1， 沙万里1， 石星星2， 高 利2， 付连军1

(1.吉林农业科技学院动物医学学院 ， 吉林吉林132101；2.东北农业大学动物医学学院 ， 黑龙江哈尔滨150030)

为了研究强痛宁麻醉下大鼠中枢脑区一氧化碳合酶(NOS)活性、NO和环乌苷酸(cGMP)浓度变化，探讨强痛宁麻醉镇痛的中枢作用机理。将24只SD大鼠随机分成4组，分别为对照组、诱导期、麻醉期和催醒期组，于不同时期采集大鼠大脑皮质、小脑、脑干、海马和丘脑。采用比色法测定NOS 活性和NO含量，酶联免疫吸附法测定cGMP浓度。结果表明，腹腔注射强痛宁6 mg/kg体重后，麻醉期各脑区NOS活性显著降低(P<0.05或P<0.01)；NO产量与对照组比较降低极显著(P<0.01)；cGMP浓度降低显著(P<0.05 或P<0.01)。结果提示，强痛宁抑制大鼠中枢脑区NOS活性，阻断NO/cGMP信号转导可能是其产生全麻作用的重要机理之一。

强痛宁 ； 一氧化氮合酶 ； 一氧化氮/环鸟苷酸 ； 信号转导

NO/cGMP信号转导通路可将胞外信号转导至细胞核，参与肌肉收缩、细胞生长和分化等生理过程[1]，是胞内重要的信号通路之一[2]。其通路中的气体信号分子一氧化氮(NO)，具有激活鸟苷酸环化酶，提高环鸟苷酸含量，维持细胞间信号传递功能[3]。环鸟苷酸(cGMP)起到传递细胞内信息作用[4]，一氧化氮合酶(NOS)是NO生成的关键酶[5]。研究发现，NO/cGMP信号转导通路介导了麻醉药对神经突触作用，产生麻醉镇痛现象[6-7]。强痛宁是一种麻醉性镇痛剂，由延胡索乙素、三七、高乌甲素、蟾蜍、冰片等成分组成的复方中药制剂，具有无依赖性、成瘾性和耐受性优点，对呼吸功能产生轻度抑制，在人类疼痛性疾病的强烈疼痛期有所应用[8-9]。在动物临床麻醉中，强痛宁作为复合麻醉或复合麻醉剂的组成部分，被广泛应用于犬、猫等宠物的临床麻醉[10]。而强痛宁产生麻醉镇痛作用机理无人报道。本试验旨在探讨强痛宁麻醉下大鼠中枢脑区NOS活性、NO和cGMP含量变化，拟从NO/cGMP信号转导通路揭示强痛宁麻醉镇痛作用分子学机理。

1 材料与方法

1.1 试验药品及主要试剂 强痛宁(浙江省医学科学院，批号130719)；NOS测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20130815)；NO测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20130812)；考马斯亮蓝蛋白质含量测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20130816)；Rat cGMP Elisa Kit(南京建成生物工程研究所，批号：20130915)。

1.2 实验动物与分组 SD纯种大鼠24只，体重200±20 g，雌雄兼备，吉林大学实验动物中心提供，同一条件下饲养2 周后进行试验。随机取6只作为生理盐水对照组(腹腔注射1.2 mL/kg体重生理盐水)，其余大鼠为试验组(腹腔注射6 mg/kg体重强痛宁溶液)。

1.3 样品采集和处理 对照组大鼠腹腔注射生理盐水后3 min断头取脑，试验组大鼠腹腔注射强痛宁后分别于诱导期(注药后5 min即可)、麻醉期(翻正反射消失即可)、催醒期(翻正反射恢复即可)断头取脑，在生理盐水冰面上迅速分离大脑皮层、海马、丘脑、小脑和脑干，分别称重，装入冻存管后投入液氮中保存。分别将脑组织取出置入冰冷的蔗糖缓冲液(0.32 mol/L，1/10，W/V)介质中匀浆，2 500 r/min离心10 min制备成10%脑组织匀浆液，待测。

1.4 检测方法 采用比色法测定NOS酶活性和NO产量，酶联免疫吸附法(ELISA)测定cGMP浓度，考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。检测具体方法参照各检测试剂盒的操作说明书进行。

2 结果

2.1 强痛宁对大鼠中枢脑区NOS活性的影响结果如图1所示，强痛宁给药后抑制了大鼠中枢脑区NOS活性，麻醉全程大鼠大脑、小脑、脑干、海马及丘脑脑区NOS活性与对照组比较降低显著(P<0.01或P<0.05)；催醒期仅丘脑NOS活性恢复到麻前水平(P>0.05)。

图1 强痛宁作用下大鼠中枢脑区NOS活性变化

2.2 强痛宁对大鼠中枢脑区NO含量的影响由图2可见，强痛宁作用下引起大鼠中枢脑区NO产量减少，麻醉全程大鼠小脑、脑干、海马及丘脑脑区NO含量与对照组比较降低显著(P<0.01 或P<0.05)；催醒期小脑NO 含量仍低于对照组(P<0.05)。

图2 强痛宁作用下大鼠中枢脑区NO含量变化

2.3 强痛宁对大鼠中枢脑区cGMP浓度的影响 按照cGMP 试剂盒操作步骤绘制吸光值与cGMP浓度的直线回归方程为y=0.341 7+0.059 4x(R2=0.990 2)，相关系数较高，线性回归良好。cGMP浓度变化见图3，强痛宁引起大鼠麻醉期中枢各脑区内cGMP浓度降低，与对照组比较差异显著(P<0.05或P<0.01)；崔醒期大鼠大脑、海马、丘脑和脑干cGMP浓度恢复到麻前水平(P>0.05)。

图3 强痛宁作用下大鼠中枢脑区cGMP浓度变化

3 讨论

NO与cGMP构成NO/cGMP信号转导通路，NO参与机体生理机能的调节，在维持清醒状态和促进cGMP合成起着重要作用[11]。中枢神经通路的兴奋性和抑制性与NO/cGMP信号转导通路关系密切，中枢神经系统(CNS)通过调节中枢NO/cGMP通路使神经细胞内cGMP含量升高引起兴奋性，cGMP含量下降引起中枢抑制[12]。

过去研究发现，多数麻醉药产生麻醉镇痛作用均与NO/cGMP信号转导通路抑制相关。王洪斌等研究结果发现，噻环乙胺麻醉下大鼠大脑皮层、海马和丘脑NOS活性被抑制，导致NO和cGMP含量下降，提示噻环乙胺麻醉与NO/cGMP信号转导通路被抑制相关[7]；刘焕奇等研究表明，NO-NOS-cGMP信号转导通路参与了赛拉唑产生全麻作用[13]；胡兴国等研究表明，异丙酚抑制大鼠小脑、海马和大脑皮层NOS活性，减少脑区NO产量和cGMP含量，提示NO/cGMP信号转导通路在异丙酚全麻分子机理中发挥重要作用[14]。本研究结果表明，腹腔注射强痛宁6 mg/kg体重后，引起麻醉期中枢脑区NOS 活性显著降低，NO产量和cGMP含量降低，提示NO/cGMP信号转导通路参与了强痛宁全麻分子机理调控。

4 结论

本研究结果表明，强痛宁抑制大鼠中枢脑区NOS活性，降低NO产量和cGMP含量，阻断NO/cGMP信号转导可能是其产生全麻作用的重要机理之一。

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[13] 刘焕奇，王洪斌，范洪刚，等.赛拉唑对大鼠不同脑区NONOS-cGMP 信号转导系统的影响[J].中国兽医学报，2010，30(4)：493-497．

[14] 胡兴国，王钧，曾因明，等.异丙酚对大鼠脑NO/cGMP信号转导系统的影响[J].临床麻醉学杂志，2000，16(2)：93-95．

Effects of the QIANG TONG NING on NO/cGMP Signal Pathway in in the Central Brain Regions of Rats

YIN Bai-shuang1， SONG Yong-li1， HU Xian-sheng1，SHA Wan-li1， SHI Xing-xing2， GAO Li2， FU Lian-jun1

(1.Department of Animal Medicine，JiLin Agricultural Science and technology，Jilin 132101，China；2.College of Animal Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

The experiment was conducted to investigate the possible molecular mechanisms of QIANG TONG NING(QTN)anesthesia on the central nervous system by analyzing the NOS activity，NO and cGMP contents in central brain regions in rats.Twenty-four SD rats were divided randomly into control group，induction group，anesthesia group,and recovery from anesthesia group.Rat brain samples of cerebral cortex，hippocampus，cerebellum，thalamus and brain stem were separated in different period under specificity anesthetic for deer anesthesia.The activity of NOS and concentration of NO were measured using colorimetry，and cGMP was determined by Elisa.The results showed that the NOS activity was significantly decreased(P<0.05 orP<0.01)，the NO contents were significantly decreased(P<0.01)，and the concentration of cGMP were also obviously decreased(P<0.05 orP<0.01)in all encephalic regions in the anesthesia group as compared with control group.These results indicated that the QTN inhibited NOS activity，and blocked NO/cGMP signal conduction suggesting that effects on NO/cGMP signal transduction may be the important mechanism of general anesthesia.

QIANG TONG NING ； NOS ； NO/cGMP ； signal pathway

FU Lian-jun

2015-12-02

国家自然科学基金项目(31302150)；吉林省科技厅发展计划项目(20140204062NY)；吉林省教育厅“十二五”科学技术项目(吉教科合字2014379)；吉林农业科技学院种子基金项目(吉农院合字2013905)

尹柏双(1978-)，男，副教授，博士，研究方向为麻醉与镇痛研究，E-mail：ybs3421@126.com

付连军，E-mail：fulianjun1968@163.com

S853.74

A

0529-6005(2016)10-0099-03