几种消毒剂对牛型结核分枝杆菌的杀菌效果试验

郭建华 ， 包美娟 ， 王 娟 ， 李前勇 ， 曹 政

(1.西南大学荣昌校区动物医学系 ， 重庆荣昌402460 ； 2.重庆澳龙生物制品有限公司 ， 重庆荣昌402460)



几种消毒剂对牛型结核分枝杆菌的杀菌效果试验

郭建华1， 包美娟1， 王 娟1， 李前勇1， 曹 政2

(1.西南大学荣昌校区动物医学系 ， 重庆荣昌402460 ； 2.重庆澳龙生物制品有限公司 ， 重庆荣昌402460)

为了研究复合酚、氢氧化钠、聚维酮碘等消毒剂在不同浓度、不同作用时间对牛型结核分枝杆菌的杀菌效果；本研究以浓度为20%、10%、5%、2%、1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.01%的消毒剂分别对牛型结核杆菌进行处理，作用时间分别为10、20、30、60 min、1、2、6、12 h；结果显示，浓度在0.2%及以上的复合酚在12 h内可杀灭牛型结核分枝杆菌，1%以上聚维酮碘处理6 h以上可杀灭牛型结核分枝杆菌，而所有试验浓度的氢氧化钠对牛型结核分枝杆菌没有杀灭作用；本研究结果表明，复合酚和聚维酮碘可用于环境的牛型结核分枝杆菌的净化。

消毒剂 ； 牛型结核分枝杆菌 ； 杀菌

结核病是由分支杆菌属结核杆菌引起的一种人兽共患慢性消耗性传染病。在家畜中，牛最易感染牛型结核分枝杆菌而发生结核病，特别是奶牛，其次是水牛和黄牛，不但造成经济损失，而且危害人畜健康。结核病是全球重要的公共卫生问题，在一些发达国家如德国、澳大利亚等国的人结核病患者中，约0.2%～0.3%是由牛型结核分枝杆菌引起的，而在埃塞俄比亚、尼日利亚、坦桑尼亚等不发达国家中，这个比例高达 17.0%～26.1%[1-2]，由此可见，控制牛结核病不仅对于动物疫病防治，还是对人健康，都具有重大的公共卫生学意义。

由于动物用药的各种限制，合理、科学的消毒在动物疫病防控中显得非常重要性。消毒可有效地杀灭养殖场、交通工具等环境中病原微生物，清除传染源，达到预防疾病，保证畜禽健康生长的目的，同时也可以保护人的健康。畜禽业目前应用较多的是各种化学消毒剂，主要分为卤素类(氯制剂、碘制剂、溴制剂)、醛类、酚类、醇类、氧化剂类、表面活性剂类、酸碱类等。已有研究者在消毒剂对结核分枝杆菌的杀灭效果方面做了研究[3-8]，但对牛型结核分枝杆菌的消毒效果，未见报道。

本试验以牛型结核分支杆菌为研究对象，研究不同浓度的聚维酮碘、复合酚以及氢氧化钠溶液，在不同的作用时间对牛型结核杆菌的杀灭作用，旨在研究这几种消毒剂的杀菌效果浓度和作用时间，为牧场、动物医院等环境的净化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株 试验菌株牛型结核分枝杆菌由国家兽医微生物菌种保藏中心提供。

1.2 培养基 改良罗氏培养基的制备参照中国防痨协会制定的“结核病诊断细菌学检验规程”[9]。称取磷酸二氢钾 14 g，枸橼酸镁 0.6 g，硫酸镁0.24 g，谷氨酸钠7.2 g，以及量取丙三醇12 mL，溶解于大约600 mL水中，加马铃薯淀粉30g，混匀，沸水浴煮1 h成糊状，待冷却后加入2%无菌的孔雀绿水溶液20 mL中，用消毒纱布过滤的新鲜鸡卵液定容至1 000 mL，混匀后分装于无菌试管内摆成斜面，90 ℃蒸汽加热90 min灭菌。冷却后随机取数支于37 ℃培养箱中进行无菌试验24 h，确定无菌后4 ℃冰箱保存备用。

2 方法

2.1 麦氏标准管的配制 本试验所需为0.1和 0.5麦氏单位。取0.1 mL浓度为1.175%BaCl2溶液与99.9 mL浓度为1%H2SO4溶液混合均匀即为0.1麦氏单位。取0.5 mL浓度为1.175%BaCl2溶液与99.5 mL浓度为1%H2SO4溶液混合均匀即为0.5麦氏单位。

2.2 消毒液的配制 将氢氧化钠、聚维酮碘、复合酚等依据卫生部卫生法制与监督司2002年编制的《消毒技术规范》按照其主要的消毒成分进行不同浓度稀释[10]，分别用无菌生理盐水配制成20%、10%、5%、2%、1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.01%消毒液。

2.3 菌株的活化、增殖、抗酸染色 取冻干菌种管，在无菌操作下打开，用无菌吸管加入0.3 mL～0.5 mL稀释液(灭菌的含0.5% Tween-80 的生理盐水)于安瓿瓶内，使冻干菌种溶解呈悬浮液，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。混匀后，将少许菌种悬浮液接入改良罗氏斜面培养基中，置于37 ℃培养。接种后第3、7、14、21、30天分别观察菌落生长及污染情况。用接种环取第1代培养物，接种于斜面培养基上，于37 ℃培养直至长出典型培养物。挑取第2 代培养物中典型菌落，接种于斜面培养基，于37 ℃培养15 d以上，即为第3代培养物。

将培养物均匀涂抹于载玻片上，用齐-尼二氏染色法染色，在光学显微镜下观察，如可见红色、抗酸性、短杆状、微弯、团状聚集菌体，偶见分枝即为牛型结核分枝杆菌。

2.4 菌悬液的制备与接种 取菌种第3代～5代的改良罗氏培养基斜面新鲜培养物(72 h内)，用5.0 mL吸管吸取3.0 mL～5.0 mL稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用5.0 mL吸管将洗液移至另一无菌试管中，用混合器混合5min，以使细菌悬浮均匀，用稀释液将菌悬液稀释至0.5麦氏单位备用。

用2.2.2配制好的9个不同浓度的消毒液分别将0.5麦氏单位的结核分枝杆菌稀释为0.1麦氏单位，稀释的同时开始计时，分别在稀释5、10、15、20、25、30、45、60、120 min、6、12、18、24 h各时刻加入生理盐水，以3 000 r/min离心20 min，收集沉淀，弃上清，反复洗涤2次后，用生理盐水配制成0.1麦氏单位菌液，取50 μL菌液接种在准备好的培养基上，试验设重复3个。37 ℃培养箱培养14 d后，分别观察结核分枝杆菌的生长情况。

2.5 结果判定 14 d后开始观察，若培养基有黄色菌落的生长，说明该消毒剂对结核杆菌没有杀灭作用，记为“+”；若没有长，说明该消毒剂对结核杆菌有杀灭作用，记为“-”。

3 结果

3.1 复合酚的杀菌试验结果 各浓度复合酚不同时间处理杀灭牛型结核杆菌试验结果如表1所示。从表1中可以看出，0.1%及以下浓度的复合酚溶液对结核杆菌没有杀灭效果。而0.2%浓度及以上的复合酚溶液在与结核杆菌作用12 h后能将其杀灭；0.5%浓度的复合酚溶液在与结核杆菌作用60 min后能杀灭结核杆菌；浓度在1%及以上的复合酚溶液与结核杆菌作用10 min后就会有杀菌效果。而0.5%以下的浓度的复合酚处理30 min以内的菌株中，可以看见呈颗粒状或菜花状的黄色菌落。

3.2 聚维酮碘的杀菌试验结果 聚维酮碘的杀菌试验结果见表2。表2显示结果为：10 min至12 h，5%及以上浓度都没有长出结核杆菌，2%浓度的则是在杀菌试验处理2 h及其以上不长出结核杆菌，2 h以内均长出结核杆菌；1%浓度在杀菌试验进行6 h后不长出结核杆菌；0.5%以下浓度在杀菌试验进行的每个时间段后均长出结核杆菌。

表1 复合酚对牛型结核分枝杆菌的杀菌效果

+：有菌落生长；-：没有菌落的生长，下表同

表2 聚维酮碘对牛型结核分枝杆菌的杀菌效果

3.3 氢氧化钠的试验结果 接种14 d后开始观察试验结果并记录结果，发现各浓度氢氧化钠处理结核杆菌没有杀灭效果。

4 讨论

结核杆菌细胞壁的脂类多为磷脂、蜡质和脂肪酸，它们与细胞壁的蛋白质和多糖结合，使细胞壁的密度增大，增强细胞壁的保护效果，防止多种杀菌药液渗入，导致结核杆菌对化学消毒剂的抵抗力较其他细菌强，从而消毒难度更大[3]。

本试验中表明，复合酚对牛型结核分支杆菌的杀灭效果较好，只是浓度较低且作用时间较短的条件下复合酚溶液对结核杆菌没有杀灭作用。正常情况下浓度在0.2%及以上的复合酚在12 h内能将结核杆菌杀灭，而浓度为1%及以上的复合酚在10 min后就可杀灭结核杆菌。

聚维酮碘是碘和1-乙烯基-2-吡咯烷酮结合形成的络合物，是中效消毒剂，通过接触细菌细胞，释放游离碘直接卤化卤体蛋白质，产生沉淀，破坏细胞膜，从而达到杀灭细菌的作用。在本试验中，2%聚维酮碘处理2 h以上才能彻底杀死牛型结核分枝杆菌，而要在较短时间杀灭菌株，需要5%以上的浓度。

本试验的氢氧化钠各浓度中，均未能杀死试验菌株，说明牛型结核分枝杆菌的耐碱性极强。在“结核病诊断细菌学检验规程”中，规定在分离牛型结核分枝杆菌的试验中，常用2%氢氧化钠处理样品来除去杂菌[9]，我们发现20%氢氧化钠处理12 h仍然不能有效杀死牛型结核分枝杆菌。

从本试验的结果来看，消毒剂的作用效果不但取决于消毒剂的浓度，也跟作用时间有关，我们在实践中不但要保证消毒剂的浓度，也要确保消毒时间充足。这点对于养殖场人员进出的消毒间尤为重要。

当然消毒剂具有一定的腐蚀性，特别是高浓度的消毒液，对人的皮肤、黏膜、口腔、眼等有损害[3]，对人表面消毒时，要在消毒剂浓度和作用时间之间做出选择，尽量选择低浓度并且作用时间短的、对人损伤小的消毒剂。

[1] Muller B，Durr S，Alonsi S，etal.Zoonotic Mycobacterium bovisinduced tuberculosis in humans[J].Emerging Infectious Diseases，2013，19(6)：899-908.

[2] World Health Organization：Global tuberculosis report 2014[M].WHO/HTM/TB/2014.08.Geneva，Switzerland：WHO；2014.

[3] 孙秀侠，许金云，李家娅.“84”消毒液对结核杆菌杀灭效果研究[J].中华医院感染学杂志，2000，10(3)：206-207.

[4] 杨修军，王艳秋，董丽丽，等.含氯复方消毒剂杀灭结核杆菌效果的试验观察[J].中国消毒学杂志，2001，18(2)：119-120.

[5] 孙巍，徐燕，谈智，等.碘伏对3株分支杆菌标准菌株杀灭效果的研究[J].现代预防医学，2012，39(16)：4223-4225.

[6] 邱梅，陈杖榴，郝智慧，等.国内外兽用消毒剂的研究现状与发展趋势[J].中国兽药杂志，2011，45(6)：43-47.

[7] 夏勇，魏兰芬，高筱萍，等.聚维酮碘消毒剂毒性的试验研究[J].中国消毒学杂志，2005，22(3)：263-267.

[8] 程萍，陈月，蒋红梅.三种常用消毒液对结核分支杆菌杀灭效果的对比[J].贵阳医学院学报，2005，30(5)：462-463.

[9] 中国防痨协会.结核病诊断细菌学检验规程[J].中国防痨杂志，1996，18(1)：28-31.

[10] 卫生部卫生法制与监督司.消毒技术规范(2002年版)[S].北京：中华人民共和国卫生部，2002.

Study on the Germicidal Efficacy of Several Disinfectant onMycobacteriumBovis

GUO Jian-hua1， BAO Mei-juan1， WANG Juan1， LI Qian-yong1， CAO Zheng2

(1.Department of Veterinary Medicine，Southwest University，Chongqing 402460，China；2.Chongqing Auleon Biologicals Company Limited，Chongqing 402460，China)

In this study,we investigated the germicidal efficacy of compound phenol，sodium hydroxide and povidone-iodine onMycobacteriumbovisunder various concentration and incubation time.The isolates cultures were incubated with different concentration of the disinfectant(with the concentrations 20%，10%，5%，2%，1%，0.5%，0.2%，0.1% and 0.01% respectively).The incubation time were 10，20，30，60 min，1，2，6 h and 12 h respectively.The results showed that 0.2% Compound phenolic and above sterilized theMycobacteriumboviswith 12h incubation.1% povidone-iodine and above sterilized theMycobacteriumboviswith incubation time at least 6 h.However even 20% sodium hydroxide had no role in killingMycobacteriumboviswith 12 h.The results showed that compound phenolic and povidone-iodine could be used as disinfectant to purify the environment forMycobacteriumbovis.

Disinfectant ；Mycobacteriumbovis； Germicidal efficacy

CAO Zheng

2015-07-14

西南大学科研基金资助(08BSr04)

郭建华(1977-)，男，副教授，博士，从事微生物资源开发与分子生物学研究工作，E-mail：guo0619@swu.edu.cn

曹政，E-mail：maodenghu@163.com

R 187.1

A

0529-6005(2016)10-0074-03