一种基于CP204L基因的非洲猪瘟病毒Taq Man-MGB实时荧光PCR检测方法的建立

王建华 ， 赵 丹 ， 张俊哲 ， 董志珍 ， 赵祥平 ， 王玉玲 ， 肖 妍 ， 王乃福 ， 陈小金 ， 陈本龙

(天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 ， 天津保税300456)



一种基于CP204L基因的非洲猪瘟病毒TaqMan-MGB实时荧光PCR检测方法的建立

王建华 ， 赵 丹 ， 张俊哲 ， 董志珍 ， 赵祥平 ， 王玉玲 ， 肖 妍 ， 王乃福 ， 陈小金 ， 陈本龙

(天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 ， 天津保税300456)

基于非洲猪瘟病毒(ASFV)CP204L基因序列设计1对特异性引物和TaqMan-MGB探针，通过优化反应条件建立了一种检测ASFV的TaqMan-MGB实时荧光PCR方法。结果显示，该方法仅对ASFVDNA呈现特异性扩增，不与猪的其他常见病毒发生交叉反应，具有良好的特异性。该方法对标准对照质粒(PCR2.1-CP204L)的线性检测范围为4.2×101～4.2×109copies/μL，标准曲线方程为Y=-3.452 3X+39.014，相关系数(R2)为0.998 8，检测下线为4.2个拷贝。对5个不同浓度(4.2×103～4.2×107copies/μL)的质粒标准品进行4次双份样品的重复检测，Ct值变异系数均小于1.5%，表明该方法具有良好的重现性。用该方法对总计164份的进口猪临床样品和生猪肌肉样品进行ASFV检测，结果均为阴性。该方法的建立为活猪临床样品和生猪肌肉样品中ASFV检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。

非洲猪瘟病毒 ； CP204L序列 ；TaqMan-MGB探针 ； 实时荧光PCR

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)引起猪的一种急性、热性和高度接触性传染病，临床症状以高热、病程短、高死亡率、内脏器官广泛性出血以及呼吸系统和神经系统功能改变为主要特征。自2009 年以来，本病经格鲁吉亚等国传播到与我国接壤的俄罗斯部分地区并多次暴发[1]，目前已对我国养猪业的持续发展构成巨大威胁。对疑似发病猪群中ASFV 快速而准确的检测，以及对可能携带ASFV 的野猪、软蜱和来自疫区的生猪产品及其制品中ASFV 的监测，是我国防控ASFV传入的重要措施。为此，本试验基于ASF VCP204L基因的保守序列设计合成特异性引物与探针，建立了一种检测ASFV的实时荧光PCR方法，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 病毒核酸样品和阳性对照质粒 非洲猪瘟病毒DNA，由意大利撒丁岛动物疫病参考实验室馈赠，伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的DNA，猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的cDNA，以及用作阳性对照的标准对照质粒(PCR2.1-CP204L)，均由天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心反刍动物检疫国家重点实验室保存。

1.2 主要试剂和仪器 组织基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技有限公司；TaKaRaTaq聚合酶、Premix ExTaqTM(Probe qPCR)，购自宝生物工程(大连)有限公司；Light Cycler®480荧光PCR仪(Rochi公司)。

1.3 引物与探针的设计与合成 选取GenBank数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载的ASFV CP204L基因序列保守区域，用BeaconDesigner7.0软件设计1对特异引物和TaqMan-MGB探针，CP204L-F：5′-GCAGGGCAAGGGTATACTGA-3′，CP204L，-P：5′-CTGTCTCCTCTTCAAACAGCAC-3′，CP204L-P：FAM-5′-CCATTCTTCTTGAGCCTG-3′-MGB，由上海英骏生物技术有限公司合成，5′端用FAM标记，3′端用MGB标记，引物和探针序列见表1，预期扩增片段长度为79 bp。

1.4 荧光PCR反应的优化 以PCR2.1-ASFV-CP204L(4.2×108copies/μL)为扩增模板，采用Premix ExTaqTM(Probe qPCR)试剂及推荐的反应体系及扩增条件，对不同浓度组合的引物(2～10 pmol/μL)和标记探针(1.5～3.5 pmol/μL)以及对56 ℃～61 ℃范围内的退火延伸温度，在荧光PCR仪上进行方阵筛选试验，以确定引物和探针的最适使用浓度和最适扩增条件。

1.5 标准曲线建立、敏感性试验、重复性试验和特异性试验 将已知浓度的PCR2.1-ASFV-CP204L做10倍系列稀释，按优化的反应条件进行实时荧光定量PCR试验，以Ct值为横坐标，以标准对照质粒起始拷贝数浓度的对数为纵坐标建立标准曲线，并确定该方法检测标准对照质粒最低拷贝数；选取5个浓度(4.2×103～4.2×107copies/μL)的质粒标准品DNA为模板，进行2个平行样品的4次重复试验，以确定该方法的可重复性；对ASFV、PRV、PPV和PCV-2的DNA以及CSFV、PRRSV、PEDV和SIV的cDNA进行荧光定量PCR检测，以确定该方法的特异性。

1.6 实际样本的检测 对2012-2014年保存的164头份进口猪的血清样品和32份进口猪肉样品，用组织基因组DNA提取试剂盒按操作说明书提取DNA，采用本试验建立的荧光定量PCR方法进行ASFV核酸检测，以评价该方法的适用性。

2 结果

2.1 荧光定量PCR反应的优化结果 通过试验筛选确定的最适荧光定量PCR扩增条件为：在25μL反应体系中，2×Premix ExTaqTM(Probe qPCR)12.5 μL，CP204L-F(7.5 pmmol/μL)、CP204L-R(7.5 pmmol/μL)和CP204L-P(2.5 pmmol/μL)各μL，样品DNA适量，补足纯水至25 μL。反应参数为95 ℃ 2 min，然后95 ℃ 10 s，56 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，45个循环，在每一次循环的60℃延伸扩增结束前采集FAM通道荧光信号。

2.2 标准品曲线建立和敏感性试验结果 对10倍系列稀释的标准对照质粒进行的荧光PCR扩增曲线及建立的标准曲线方程分别见图1A和图1B，由图1A可知该方法最低可检出4.2拷贝数的标准对照质粒DNA分子。该方法检测标准对照质粒的线性检测范围为4.2×101～4.2×109 copies/μL，标准曲线方程为Y=-3.452 3X+39.014，相关系数(R2)为0.998 8。

图1 对照质粒标准品(4.2×100～4.2×109 copies /μL)荧光PCR动力学曲线(A)和标准曲线曲线(B)

a，b，c，d，e，f，g，h，i分别为4.2×109copies、4.2×108copies、4.2×107copies、4.2×106copies、4.2×105copies、4.2×104copies、4.2×103copies、4.2×102copies、4.2×101copies、4.2×100copies对照质粒标准品的扩增曲线

2.3 特异性、重复性和实际样本检测结果 用该方法检测ASFV及相关病毒基因组核酸，仅ASFV的DNA出现典型的扩增曲线，而PRV、PPV和PCV-2的DNA以及CSFV、PRRSV、PEDV和SIV的cDNA>均无扩增曲线出现，表明该方法检测ASFV核酸有良好的特异性。对5个不同浓度(4.2×103～4.2×107copies/μL)的质粒标准品进行4次双份样品的重复检测，结果见表1，由表1可知Ct值变异系数均小于1.5%，表明该方法具有良好的重现性。对2012-2014年保存的162头份进口猪血清样品和32份进口猪肉样品进行ASFV核酸检测，结果均为阴性。

表1 非洲猪瘟病毒P30基因荧光PCR重复性试验结果

3 讨论

荧光PCR方法不仅适用于急性感染早期家猪组织样本中ASFV检测，而且更适用于持续性感染的野猪和软蜱的组织样本中ASFV检测。已知ASFV基因组由单分子线状双股DNA组成，长度为170～190 kb，含有大量的毒力相关基因和宿主范围相关基因[2]。国外King等(2003)最早基于VP72基因建立了检测ASFV核酸的荧光PCR方法[3]国内董志珍(2009)等和郭少平(2010)等分别基于，p54基因和K205R基因建立了检测ASFV核酸的TaqMan探针荧光PCR方法[4-5]均显示出很高的敏感性。由于CP204L是ASFV在，感染细胞早期高丰度表达的一种编码P30蛋白的基因，该蛋白是目前已知的激发感染动物产生抗体和用于ASFV特异抗体检测的主要蛋白抗原之一[6]。为此，本试验基于CP204L基因建立了一种TaqMan-MGB探针荧光PCR方法，试验表明，该方法检测ASFV核酸不仅特异性强，而且最低可检测4.2个拷贝的标准阳性对照质粒，为我国预防ASFV的传入和传播提供了一种快速而准确的监测手段。

[1] Gogin A，Gerasimov V，Malogolovkin A，etal.African swine fever in the North Caucasus region and the Russian Federation in years 2007-2012[J].Virus Res，2013，173(1)：198-203.

[2] Dixon L K，Chapman D A，Netherton C L，etal.African swine fever virus replication and genomics[J].Virus Res，2013，173(1)：3-14.

[3] King D P，Reid S M，Hutchings G H，etal.Development of a TaqMan PCR assay with internal amplification control for the detection of African swine fever virus[J].J.Virol.Methods，2003，107：53-61.

[4] 董志珍，侯艳梅，赵祥平，等.非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立[J].中国兽医杂志，2009年，45(9)：3-6.

[5] 郭少平，刘建，吴绍强，等.非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测技术的研究与评价[J].中国畜牧兽医，2010，37(4)：76-80.

[6] Prados F J，Vinuela E，Alcami A.Sequence and characterization of the major early phosphoprotein p32 of African swine fever virus[J].J.Virol，1993，67：2475-2485.

Development of aTaqMan-MGB probe real-time PCR assay for detection of african swine fever virus based on CP204L gene

WANG Jian-hua ， ZHAO Dan ， ZHANG Jun-zhe ， DONG Zhi-zhen ， ZHAO Xiang-ping ，ANG Yu-ling ， XIAO Yan ， WANG Nai-fu ， CHEN Xiao-jin ， CHEN Ben-long

(The Animals and Plants and Food Inspection Center of Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine，Tianjin 300456，China)

By optimization of reacting conditions，aTaqMan-MGB probe real-time PCR was developed with a pair of specific primers and probe designed according to the conserved regions of the CP204L gene sequences of African swine fever virus(ASFV).The method had high specificity for the ASFV DNA and no cross-reactivity was observed among DNAs and cDNAs of other common swine viruses.The assay showed good linearity between Ct values and copies of the standarde plasmid from 4.2×101to 4.2×109copies/reaction(standard equation Y=-3.4523X+39.014，correlation coefficient R2=0.9988)，and the detection limit of the assay was as low as 42 copies of the standarde plasmid.Coefficiency of variation(CV)of Ct values of the standard plasmid tested in duplicate four times ranging from 4.2×103to 4.2×107copies/μL by the assay were less than 1.5%.The164 samples from the imported pigs and porks were detected to be negative by the assay.In conclusion，the method provides a useful tool for the detection of ASFV in the samples from the pigs and porks.

African swine fever virus；CP204L gene ；TaqMan-MGB probe ； real-time quantitative PCR

2015-07-31

天津市科技支撑项目(13ZCZDNCO1300)；天津市滨海新区惠民项目(2013-BK15H013)

王建华(1965-)，男，高级兽医师，博士，从事动物疫病检测与诊断试剂研制工作，E-mail：wjhwqy1965@163.com

S852.65+1

A

0529-6005(2016)10-0023-03