两种合成生物活性肽对人工感染大肠杆菌新城疫病毒肉鸡的保护试验

初欢欢 ， 杨海燕 ， 王述柏 ， 刘 斌

(青岛农业大学动物科技学院 ， 山东青岛266109)



两种合成生物活性肽对人工感染大肠杆菌新城疫病毒肉鸡的保护试验

初欢欢 ， 杨海燕 ， 王述柏 ， 刘 斌

(青岛农业大学动物科技学院 ， 山东青岛266109)

为了研究两种合成生物活性肽对肉鸡的抗菌、抗病毒作用。将1 440只1日龄AA肉鸡随机分为8个处理：6个试验组分别为两种肽的低、中、高(10、20、40 μg/kg体重)剂量组，2个对照组分别为杆菌肽锌组及空白组，每组设6个重复，每重复30只，试验期42 d。于10 d进行攻菌保护试验，于33 d进行攻毒保护试验。试验结果表明，20、40 μg/kg体重肽 I μg/kg 和40 μg/kg体重肽Ⅱ具有良好抗大肠杆菌活性，40 μg/kg体重肽I和肽Ⅱ具有良好抗新城疫病毒活性。结论是试验所用两种活性肽产品对肉鸡人工感染大肠杆菌和新城疫病毒均有良好保护作用。

活性肽 ； 大肠杆菌 ； 新城疫病毒 ； 攻毒保护

新城疫和大肠杆菌病作为禽类高发性传染病，严重危害养禽业的发展，使得安全有效、不易产生耐药性的新型抗菌抗病毒产品成为当前研究的热点。生物活性肽作为动物体天然存在的生理活性调节物，具有抗菌、抗病毒、促生长、提高机体免疫力等功能，是一类较为理想的抗生素类替代品。本试验研究了两种合成生物活性肽对人工感染大肠杆菌和新城疫病毒肉鸡的保护作用，旨在了解其应用于肉鸡的抗菌及抗病毒作用效果及使用剂量，从而为其在肉鸡生产上推广应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 两种合成生物活性肽(肽I 和肽Ⅱ，分别由9 个、7 个氨基酸组成，由上海九川公司提供)；致病性大肠杆菌：大肠杆菌质控菌株(25922)；新城疫病毒(NDV)：F48E9 株，由中国动物与流行病学中心提供。

1.2 试验动物分组及饲养管理 1日龄AA 肉仔鸡1 440 只，随机分为8 个处理，每个处理180 只鸡，设6 个重复，每重复30 只鸡。试验分组与处理见表1。所有组均饲喂同一基础饲粮，饲粮营养水平参照中国肉鸡饲养标准(NY/T33-2004)设置，各组饲养管理条件一致。

1.3 攻菌试验

1.3.1 攻菌剂量筛选试验 大肠杆菌接种于普通培养基上，37 ℃培养24 h，挑取典型菌落于MH肉汤中，37 ℃培养18 h。用分光光度计测定OD值，PBS稀释至108个/mL(平板计数法测定)和0.5麦氏浓度(108个/mL，分光光度计625 nm测定吸光度0.08～0.10)。

表1 试验分组与处理

攻菌剂量筛选：24只7日龄试验鸡随机分为8组，于8 d胸肌注射108个/mL和109个/mL两种浓度菌液0.1、0.2、0.4、0.5 mL，每个剂量依次注射3只鸡，攻菌后3～48 h内观察记录发病及死亡情况，病死鸡剖检，确定为大肠杆菌感染所致，并确定正式攻菌试验的剂量[1]。

1.3.2 大肠杆菌攻菌试验 于7d每组每重复随机取5只鸡(每组共30只)，饲养于预先消毒好的试验笼适应3 d，于10 d进大肠杆菌攻菌试验，胸肌注射筛选的最佳剂量及浓度的大肠杆菌菌液。观察肉鸡临床症状。

1.4 攻毒试验

1.4.1 攻毒剂量筛选试验 鸡新城疫病毒EID50测定：新收获的待测NDV感染鸡胚尿囊液，用无菌生理盐水作10倍系列稀释。每个稀释度一组，每组3枚，绒毛尿囊腔接种9～10日龄鸡胚，置于37 ℃孵化3 d，观察记录鸡胚死亡感染情况[2]。经测定新城疫病毒EID50为10-6。

攻毒剂量筛选：12只体重相近21日龄试验鸡随机分为6组，每组两只，适应环境3 d后，于24 d进行攻毒剂量筛选试验。分别采用104、105、106倍EID50浓度(即病毒原液稀释102、10、1倍)0.1 mL肌肉注射，观察感染及死亡状况。然后分别采用上述结果中适中浓度0.1 mL、0.2 mL两个剂量，每个剂量3只，进行肌肉注射，观察感染及死亡状况，确定正式攻毒的浓度及剂量。

1.4.2 新城疫病毒攻毒试验 于29 d，每组每重复随机取5只试验鸡(每组共30只)，饲养于预先消毒的试验笼，适应环境3 d后，于33 d进行新城疫病毒攻毒试验，试验鸡肌肉注射筛选的最佳浓度及剂量的新城疫病毒。观察肉鸡临床症状。

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌攻菌保护试验结果 大肠杆菌攻菌剂量筛选试验确定攻菌浓度为109个/mL，剂量 0.2 mL。攻菌试验结果见表2。由表2可知，肉鸡存活率空白对照组最低，肽I低、中、高剂量组分别较空白对照组高4.40%、14.87%、9.54%；肽Ⅱ低、中、高剂量组分别较空白对照组高7.69%、9.54%、13.54%；杆菌肽锌组较空白对照组高3.47%。各试验组存活率均高于杆菌肽锌组。保护率空白对照组和肽Ⅱ低剂量组最低，肽I低、中、高剂量组保护率分别较空白对照组高2.75%、5.13%、4.46%；肽Ⅱ中、高剂量组分别较空白对照组高0.46%、4.46%；杆菌肽锌组较空白对照组高1.36%。可见，20、40 μg/kg体重肽I和40 μg/kg体重肽Ⅱ对人工感染大肠杆菌肉鸡有良好保护作用。

表2 大肠杆菌攻菌保护试验结果

2.2 新城疫病毒攻毒保护试验结果 新城疫病毒攻毒剂量筛选试验确定攻毒浓度为106倍EID50浓度，即原病毒液稀释100倍，剂量0.2 mL。攻毒试验结果见表3。由表3可知，存活率空白对照组最低，肽I低、中、高剂量组分别较空白对照组高 3.34%、3.34%、6.67%；肽Ⅱ低、中、高剂量组分别较空白对照组高6.67%、6.67%、10.00%。保护率空白对照组和肽I中剂量组最低，肽I低、高剂量组保护率分别较空白对照组高3.33%、6.67%；肽Ⅱ低、中、高剂量组分别较空白对照组高10.00%、6.67%、10.00%。可见，40 μg/kg体重肽I和肽Ⅱ对人工感染新城疫病毒有良好保护作用。

表3 新城疫病毒攻毒保护试验结果

3 讨论

目前已有较多研究证实生物活性肽可以一定程度改善机体细菌危害和耐药性问题。杨海燕等(2014)[3]采用攻菌试验研究了复合生物活性肽对SPF鸡抗病力的影响，结果表明，接种大肠杆菌后试验组保护率比对照组高20%。郑健(2011)[4]研究表明，卵转铁蛋白抗菌活性肽对革兰阳性菌及革兰阴性菌均具有抑制作用，对革兰阳性菌更敏感。赵瑞利等(2013)[5]报道牛蛙活性肽Catesbeianin-1a对猪链球菌等具有较好的抑菌活性。本试验表明饲喂两种活性肽，对人工感染大肠杆菌均有一定的保护效果，高剂量组效果较好，与上述报道结果类似。研究表明，活性肽产品具有提高机体免疫作用、抗病毒功效。孙芳(2007)[6]制取的东北林蛙皮肤活性肽对人流感病毒具有抑制作用。曹云飞(2010)[7]研究证明，蝇抗病毒肽Alloferon1对PRRSV和NDV具有良好的抑制作用。本试验结果表明，40 μg/kg体重肽I和肽Ⅱ对人工感染新城疫病毒肉鸡有良好保护作用，说明这两种肽作为饲料添加剂使用对肉鸡抵抗新城疫病毒感染具有良好作用。

4 小结

本试验所用的两种人工合成活性肽产品，对肉鸡感染大肠杆菌和新城疫病毒均有一定保护作用，作用效果随其剂量增加呈增强趋势，40 μg/kg体重剂量具有最佳抗菌抗病毒活性。

[1] 王妮，张万福，贾雪莲，等.中药复方制剂对人工感染鸡大肠杆菌病疗效的研究[J].现代畜牧兽医，2012(03)：46-48.

[2] Cattoli G，Susta L，Terregine C，etal.Newcastle disease:a review of field recognition and current methods of laboratory detection[J].Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，2011，23(04)：637-656.

[3] 杨海燕，靳继惠，张传美，等.一种新型复合生物活性肽对SPF鸡抗病力和生长性能的影响[J].黑龙江畜牧兽医，2014，10(上)：144-146.

[4] 郑健.卵转铁蛋白抗菌活性肽的制备及其抑菌活性的研究[D].长春：吉林大学，2011.

[5] 赵瑞利，韩俊友，韩文瑜，等.新牛蛙活性肽Catesbeianin-1a的抗菌抗肿瘤作用[J].中国兽医学报，2013，33(09)：1407-1411.

[6] 孙芳.东北林蛙皮肤活性肽HPLC分离纯化及体外抗病毒活性研究[D].哈尔滨：东北林业大学，2007.

[7] 曹云飞.天蚕素A-蛙皮素杂合肽、抗菌肽DermaseptinS4、丽蝇抗病毒肽Alloferon1体外抗病毒活性研究[D].兰州：甘肃农业大学，2010.

Protective Experiment of Two Kinds of Bioactive Peptides on Broilers Artificially InfectedE.coliand Newcastle Disease Virus

CHU Huan-huan ， YANG Hai-yan ， WANG Shu-bai ， LIU Bin

(College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China)

This study was designed to investigate the antibacterial and antiviral effects of two synthetic bioactive peptides on broilers.1 440 one-day old AA broilers were randomly divided into 8 groups with 6 replicates，in each group and 30 broilers in per replicate.The low，middle and high doses(10，20，40 μg/kg body weight)of two peptides were used to treat the broilers，and bacitracin zinc and blank group were used as control groups.The test lasted 42 days.The challenge protection test usingE.coliwas conducted with 10 day-old broilers，and the challenge protection test using Newcastle disease virus was conducted with 33 day-old broilers.The doses of 20，and 40 μg/kg body weight of peptideⅠand 40 μg/kg body weight of peptideⅡshowed good antibacterial activity toE.coli，and 40 μg/kg body weight of peptideⅠandⅡshowed good antiviral activity to Newcastle disease virus.We conclude that the two products of bioactive peptides had good protection to broilers infected withE.coliand Newcastle Disease Virus.

Bioactive peptides ；E.coli； Newcastle disease virus ； Challenge protection

WANG Shu-bai

2015-07-31

山东省自主创新及成果转化专项(2014ZZCX071-05)；国家国际科技合作专项(2014DFR30980)；青岛市公共领域科技支撑计划项目(12-1-3-30-nsh)；山东省2014 年农业重大应用技术创新课题(肉鸡饲用活性肽制备关键技术研究与应用)

初欢欢(1991-)，女，硕士生，研究方向为预防兽医学，E-mail：15275210115@126.com

王述柏，E-mail：wshubai@163.com

S852.61+2

A

0529-6005(2016)10-0020-02