基质金属蛋白酶-3基因多态性与无症状性颈动脉狭窄的相关性

2016-12-21 09:58黄小亚韩丽雅黄向东管朝红茅新蕾林彩丹
浙江医学 2016年18期
关键词:等位基因蛋白酶多态性

黄小亚 韩丽雅 黄向东 管朝红 茅新蕾 林彩丹

基质金属蛋白酶-3基因多态性与无症状性颈动脉狭窄的相关性

黄小亚 韩丽雅 黄向东 管朝红 茅新蕾 林彩丹

目的 探讨中国汉族人群基质金属蛋白酶-3(MMP-3)基因多态性与无症状性颈动脉狭窄的关系。方法 选择2011年1月至2013年12月来院体检的425例年龄≥60岁健康者为研究对象,经颈动脉超声检测,其中颈动脉狭窄(≥50%)65例,无颈动脉狭窄360例;并采用聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性方法,分析与比较两组人群MMP-3基因启动子区-1171位点的5A/6A多态性。结果 颈动脉狭窄与无狭窄人群基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(均P>0.05);两组人群MMP-3 5A/6A基因型和5A等位基因分布比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。经logistic回归模型分析,校正多项血管危险因素后,5A/6A或5A/5A基因型是无症状性颈动脉狭窄的独立危险因素(OR=1.98,95%CI:1.05~3.72)。结论 MMP-3基因启动子区-1171位点的5A/6A多态性与无症状性颈动脉狭窄的发生可能相关。

基质金属蛋白酶-3 基因多态性 无症状性颈动脉狭窄

脑卒中是目前成人第一位致残原因和第二位致死原因[1]。相关研究表明脑卒中发病率存在人种、区域差异,其中以中国为代表的东亚地区是脑卒中高发地区[2]。脑梗死是脑卒中最常见的类型,约占全部脑卒中的80%,具有发病率高、病死率高、致残率高、复发率高等特点。近年来我国人群预期寿命延长,人口老龄化不断加快,脑梗死发病率持续上升[3]。除了时间窗内静脉溶栓和动脉介入治疗外[4-5],目前仍缺乏有效的脑梗死早期诊断与防治方法。因此,早期筛选出脑梗死高危人群和易感个体,积极做好早期预防,对降低脑梗死发病率、致残率和病死率具有重要意义。细胞外基质(ECM)是组成血管壁的“骨架”,不仅保证了血管壁的弹性和对牵拉的抵抗性,还为血管壁细胞传递增殖、迁移、分化和凋亡等调控信号,调节血管壁细胞对生长因子和趋化因子的反应能力。ECM的异常降解可引起血管中层平滑肌细胞侵袭和迁移至内膜,与动脉粥样硬化形成的病理过程密切相关。基质金属蛋白酶(MMPs)是锌、钙依赖的内肽酶家族,对ECM成分有较高的亲和力,几乎可以降解所有ECM成分,参与机体多种病理、生理过程[6]。基质金属蛋白酶-3(MMP-3)是MMPs家族的重要成员,在调节ECM重构过程中发挥重要作用。前期研究发现MMP-3基因启动子区-1171位点的5A/6A多态性与动脉粥样硬化性脑梗死、颈动脉易损斑块等密切相关[7-8];而本研究旨在探讨该位点多态性与中国汉族人群无症状性颈动脉狭窄间的关系,为早期筛选脑梗死高危人群提供理论依据。

1 对象和方法

1.1 对象 以2011年1月至2013年12月在本院体检的425例健康者为研究对象,其中男245例,女180例,年龄60~87(70.06±5.53)岁;均为中国浙江地区的汉族人,彼此无血缘关系,均无心血管、脑血管及外周血管病史,排除感染、自身免疫性疾病、恶性肿瘤、肝肾功能不全等疾病。颈动脉狭窄65例(15.29%),其中存在2处及以上斑块29例,孤立性斑块36例,共检出斑块106处,包括易损斑块31处,混合斑块23处,稳定斑块52处;左侧斑块69处,右侧斑块37处。无颈动脉狭窄360例,占84.71%。颈动脉狭窄人群高血压、高脂血症患病比例均明显高于无颈动脉狭窄组(均P<0.05),而年龄、性别、糖尿病患病比例、吸烟比例和BMI水平两组比较差异均无统计学意义(均P>0.05),见表1。本研究经医院临床研究伦理委员会批准,且所有研究人员签署知情同意书。

表1 颈动脉狭窄与无颈动脉狭窄人群的一般资料比较

1.2 方法

1.2.1 一般资料登记 一般资料包括年龄、性别、身高、体重、吸烟史以及高脂血症、高血压、糖尿病病史。高血压的诊断标准:既往有高血压病史,或目前正在使用降压药物控制血压,或收缩压和(或)舒张压≥140/ 90mmHg,排除继发性高血压。高脂血症的诊断标准:根据中华医学会心血管病学分会1997年制定的《血脂异常防治建议》诊断标准。糖尿病的诊断标准:依据WHO制定的诊断标准[9],同时排除1型糖尿病及继发性糖尿病患者。吸烟的定义:每日吸烟≥1支且连续吸烟时间≥1年,包括既往吸烟和目前仍在吸烟者。

1.2.2 颈动脉超声检测 采用美国产GE Vivid 7型彩色多普勒超声诊断仪,探头频率为7.5MHZ,由超声诊断科高年资医师操作,分别检测双侧颈总动脉、颈动脉分叉处、颈内动脉和颈外动脉。受检前休息5min,检查时取仰卧位,颈后垫枕,颈部放松,头偏向检查对侧,显露检查一侧颈部,依次检查双侧颈动脉。颈动脉狭窄依据2003年美国超声放射学学会制定的颈内动脉狭窄的超声诊断标准[10];参考既往研究,当颈动脉狭窄50%~60%时,临床卒中事件随之增加[11],故本文将颈动脉狭窄≥50%定义为颈动脉狭窄,若受检者双侧颈内动脉存在狭窄,则取较严重侧的狭窄值作为其狭窄值。

1.2.3 聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性方法(1)主要试剂:血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)购自上海捷瑞生物工程有限公司;限制性内切酶Psy I及缓冲液均购自New England Biolabs公司;PCR产物纯化试剂盒购自上海生工公司,引物由上海基康公司合成。(2)标本采集:采集入选对象空腹12h的静脉血,用于生化指标测定及DNA抽提;其中用于基因组DNA抽提的血标本2ml,以EDTA-Na2抗凝,于-80℃冰箱中冻存备用。(3)DNA的抽提:按照全血基因组DNA抽提试剂盒操作步骤进行DNA抽提。(4)参照Dunleavey等[12]的方法扩增MMP-3基因启动子区-1171位点及其侧翼区,上游引物A:5′-GGT TCTCCATTCCTTTGATGGGGGGAAAGA-3′;下游引物B:5′-CTTCCTGGAATTCAC ATCACTGCCACCACT-3′。PCR反应体系:10×缓冲液2.5μl,dNTP(各10mmol/L)0.5μl,上下游引物0.5μl+0.5μl(各20μmol/L),DNA模板0.1μg,Taq DNA聚合酶2U,加双蒸水至总体积25μl。PCR反应条件:预变性95℃2min,变性94℃45s,退火65℃1.5min,延伸72℃2min,共35个循环,最后72℃延伸10min。反应结束后,短暂离心,吸取扩增产物5μl,于1.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,凝胶成像分析PCR产物特异性。(5)酶切反应:取经纯化后的PCR产物进行酶切,反应体系包括PCR产物1μg,10×缓冲液2μl,限制性内切酶 Psy I 2.5U,加双蒸水至总体积20μl,置37℃水浴16h,终止酶切反应,产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳后,EB染色,使用凝胶成像系统判定结果。

1.3 统计学处理 应用SPSS 20.0统计软件。计量资料用表示,组间比较采用两独立样本t检验;计数资料用率表示,组间比较采用χ2检验;颈动脉狭窄组与无颈动脉狭窄组均采用Hardy-Weinberg平衡评价基因分布特点;MMP-3 5A/6A基因型与颈动脉狭窄的风险采用多元logistic回归模型预测,校正因素包括:年龄、性别、高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟史及BMI。

2 结果

2.1 颈动脉狭窄与无狭窄人群MMP-3 5A/6A基因型和等位基因的分布 颈动脉狭窄组中6A/6A基因型47例,5A/6A基因型18例,无5A/5A基因型;颈动脉无狭窄组中6A/6A基因型306例,5A/6A基因型52例,5A/ 5A基因型2例。因5A/5A基因型所占比例较小,故本文将5A/6A、5A/5A基因型合并统计。经检验,颈动脉狭窄(χ2=1.68,P=0.20)与无狭窄(χ2=0.02,P=0.90)人群基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡。颈动脉狭窄与无狭窄人群MMP-3 5A/6A基因型和等位基因分布比较,差异均有统计学意义(χ2=6.09、4.96,均P<0.05),见表2。

表2 颈动脉狭窄与无狭窄人群MMP-3 5A/6A基因型和等位基因的分布(例)

2.2 MMP-3 5A/6A基因型与颈动脉狭窄风险的logistic回归分析 在未校正其他因素的情况下,5A/6A或5A/5A基因型携带者发生颈动脉狭窄的风险较6A/6A基因型携带者增加1.17倍(OR=2.17,95%CI:1.17~4.02)。校正年龄和性别后,5A/6A或5A/5A基因型携带者发生颈动脉狭窄的风险较6A/6A基因型携带者增加1.18倍(OR=2.18,95%CI:1.18~4.05)。校正年龄、性别、高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟史和BMI后,5A/6A或5A/5A基因型携带者发生颈动脉狭窄的风险较6A/6A基因型携带者增加0.98倍(OR=1.98,95%CI:1.05~3.72),见表3。

表3 MMP-3 5A/6A基因型与颈动脉狭窄风险的logistic回归分析

3 讨论

颈动脉粥样硬化是导致脑梗死的一个重要原因[13]。既往研究发现中度(狭窄≥50%)无症状性颈动脉狭窄患者中,年龄≥70岁的男性占12.5%,而高龄女性占7%[14]。存在无症状性颈动脉狭窄的患者,发生同侧颈动脉供血区的脑梗死、急性冠状动脉事件和血管性死亡的危险性增高[15-16]。从血管内皮细胞功能障碍到血管内斑块形成,再到临床缺血事件的发生,慢性炎症反应均起到重要作用,在这一系列病理过程中,炎症细胞所分泌的MMPs是其主要环节。

MMP-3是MMPs家族的主要成员,可由体内多种细胞分泌,它既能降解胶原、蛋白聚糖、弹性蛋白、纤维连接蛋白等ECM成分,又可激活其他MMPs,形成一个正反馈环,共同调节细胞的增殖和迁移。人类MMP-3基因位于染色体11q22.3,含有10个外显子和9个内含子。相关研究发现MMP-3启动子序列中1个常见的变异位于由转录起始上溯600 bp,在此部位1个等位基因有6个腺苷核苷(6A),而其他只有5个腺苷核苷(5A),且体外实验显示5A等位基因所介导的转录活性是6A的2倍[17-18]。

MMP-3基因启动子区-1171位点的5A/6A多态性在1995年首次被描述,即6A/6A基因型会加速冠状动脉粥样硬化的进程[19]。随后一系列研究发现MMP-3 5A/6A多态性与动脉粥样硬化性疾病关系密切。Hirashiki等[20]对经冠状动脉造影确诊为冠状动脉粥样硬化的患者进行研究,发现6A/6A基因型与冠状动脉严重狭窄支数密切相关。Beyzade等[21]亦得出相同结论,并发现至少有1支冠状动脉狭窄率>50%的人群中,5A/5A基因型携带者心肌梗死发病率明显增高。A-billeira等[22]一项荟萃分析显示5A等位基因与急性心肌梗死相关,提示5A等位基因在易损斑块形成中具有一定作用。笔者前期研究发现5A等位基因携带者发生颈动脉易损斑块和动脉粥样硬化性脑梗死的风险均明显升高[7-8];而本研究结果显示颈动脉狭窄人群5A/6A+5A/ 5A基因型频率和5A等位基因频率均明显高于无颈动脉狭窄人群,具体机制有待于进一步探讨。

综上所述,MMP-3基因启动子区-1171位点的5A/6A多态性与无症状性颈动脉狭窄的发生相关;5A等位基因可能是颈动脉狭窄的遗传易感基因,具体作用机制有待进一步研究。

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Association between matrix metalloproteinase-3 5A/6A polymorphism and prevalence of asymptomatic carotid artery stenosis

HUANG Xiaoya,HAN Liya,HUANG Xiangdong,et al.Department of Neurology,Wenzhou Central Hospital&Dingli Clinical Institute of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,China

Objective To investigate the relationship between matrix metalloproteinase-3 (MMP-3)-1171 5A/6A polymorphism and the prevalence of asymptomatic carotid artery stenosis in Han Chinese population. Methods Total 425 healthy subjects aged≥60 years were enrolled in this study from January 2011 to December 2013.The genotypes of MMP-3 promoter polymorphism (-1171 5A/6A)were determined using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP). Results Among 425 subjects 65 showed evidence of asymptomatic carotid artery stenosis.The genotype distributionsof the asymptomatic carotid artery stenosisgroup and the non-stenosisgroup were both in Hardy-Weinberg equilibrium(P>0.05).The frequencies of MMP-3 5A/6A+5A/5A genotype and 5A allele in the asymptomatic carotid artery stenosis group was significantly higher than those in non-stenosis group(P<0.05).After adjustment for vascular risk factors,multivariate logistic regression analysis showed that the MMP-3 5A/6A+5A/5A genotype was an independent risk factor for asymptomatic carotid artery stenosis(OR=1.98,95%CI:1.05-3.72). Conclusion The MMP-3(-1171 5A/6A)polymorphism may contribute to susceptibility of asymptomatic carotid artery stenosis.

Matrix metalloproteinase-3 Polymorphism asymptomatic Asymptomatic carotid antery stenosis

2016-05-23)

(本文编辑:陈丹)

浙江省温州市科技计划项目(Y20140531)

325000 温州市中心医院(温州医科大学定理临床学院)神经内科

黄小亚,E-mail:huangxiaoya389@163.com

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