流式细胞术在骨髓增生异常综合征中的研究进展

张帅丹 郑智茵 刘永林 胡通林

●综 述

流式细胞术在骨髓增生异常综合征中的研究进展

张帅丹 郑智茵 刘永林 胡通林

骨髓增生异常综合征（MDS）是一组造血干细胞恶性克隆性疾病，其基本临床表现是外周血一系或多系血细胞减少和骨髓出现病态造血，MDS具有向急性髓系白血病（AML）转化的高风险性。从FAB分型到2008年WHO分型，MDS的诊断标准已从单一的形态学标准更新至多指标综合诊断。其中，细胞遗传学是一种客观的检测方法。但在骨髓涂片标本质量欠佳、样本采取量不足、细胞形态学表现不典型等情况下，纵使综合相关的细胞遗传学和分子生物学检测，也只有40%～70%的MDS患者存在异常[1]。而一些伴有轻微血细胞减少的疾病并不伴有细胞遗传学异常，此时也难以与MDS相鉴别。因此，需采取其他辅助诊断指标以排除非克隆性因素引起的、易与MDS混淆的其它血细胞减少疾病。自2008年WHO修正了髓系肿瘤和急性白血病分型系统以来，在检测肿瘤表面抗原的异常表达和急性白血病诊断方面，流式细胞术（FCM）已被公认为一种客观的检测方法。许多研究小组致力于多参数FCM对MDS的诊断和预后评估。笔者复习了FCM在MDS髓系、红系、巨核系等异常免疫表型研究中的应用及发展的国内外报道，就FCM在MDS诊断及预后评估中的作用及地位作一综述。

1 FCM在MDS研究中的历史回顾

FCM在分析MDS患者血细胞免疫表型异常方面是一项可靠的检测方法，对于一些无细胞遗传学异常但有轻微血细胞减少，或具有典型的遗传核型和血细胞减少但缺乏形态学异常发育的疑似MDS患者，可采用FCM进行检测。2007年美国国家综合癌症网络（NCCN）、MDS国际工作组（IWG）、欧洲白血病网（ELN）等众多专家在维也纳召开了MDS诊断与治疗相关会议[2]，明确提出了MDS的最低诊断标准（维也纳标准）。但由于依据不足，FCM检测并未列入MDS的最低诊断标准。2009年Ogata等[3]提出基于多参数的FCM检测可用于缺乏特异标志的低危MDS诊断并提出Ogata评分。2012年欧洲白血病流式工作组（IMDSFlow）强调FCM应作为MDS综合诊断中必不可少的一部分而不仅仅作为一项单独的诊断指标[4]。2013年FCM作为一项推荐性诊断指标被ELN指南纳入，用于MDS诊断与治疗方案的选择[5]。2014年美国血液学杂志中提出，在最小不典型增生的MDS案例诊断中FCM可以辅助识别异常表型[6]；同年IMDSFlow再次肯定FCM在诊断MDS过程中可作为一项有用的诊断指标[7]。由此，FCM在MDS诊断中的重要地位日益凸显。

2 MDS异常细胞免疫表型的FCM检测表现

FCM通过结合侧向散射光（SSC）和前向散射光（FSC）参数，检测并识别红系、髓系以及巨核系等异常细胞免疫表型，发现骨髓细胞的异常分化，从而明确诊断MDS[8]。

2.1 MDS髓系的异常细胞免疫表型 文献研究证明髓系的FCM检测比细胞形态学更敏感[1，9]。Stetler-Stevenson等[1]采用FCM检测45例MDS患者骨髓各系的病态造血，结果提示FCM检测髓系和红系的灵敏度分别为98%（39/40）和77%（32/42）。髓系异常细胞免疫表型多为CD13、CD33高表达，CD15、CD10低表达，以及造血干/祖细胞标志CD34、HLA-DR高表达、髓系SSC降低等。孙雪静等[10]采用多色FCM检测并进行CD45/SSC双参数设门，分析38例MDS和24例非MDS患者粒细胞及单核细胞的免疫表型，发现MDS组CD10几何平均荧光强度、粒细胞的SSC低于非MDS组。Rashidi等[11]也得出类似结论。除了单一的抗体表达，粒细胞表面也可出现CD13/CD11b、CD13/CD16、CD11b/CD16抗体组合模式异常[12]。

由于再生障碍性贫血（AA）和MDS均可表现为外周血细胞减少，且部分难治性贫血（RA）患者病态造血不典型或仅有骨髓增生低下，仅靠细胞形态学很难与AA鉴别。Huang等[13]研究证实MDS组患者骨髓髓系细胞CD13、CD33、CD34及HLA-DR表达高于AA组，而CD15和CD10显著低于AA组（均P＜0.05），并且随着RA向难治性贫血伴原始细胞增多（RAEB）进展，髓系细胞CD13、CD33、CD34及HLA-DR表达逐渐升高。因此，检测骨髓髓系细胞免疫分型有利于更好区分AA和MDS。

2.2 MDS红系的异常细胞免疫表型 由于特殊标记使用的局限性，FCM检测红系病态造血应用较少。白细胞共同抗原CD45、转铁蛋白受体（CD71）、血型糖蛋白A（CD235a）结合早期祖细胞标记CD117、CD34以及红细胞分化标记CD105、CD36可用于检测早期及晚期红系组细胞正常分化模式[14]。MDS患者多见CD36、CD71低表达，CD105高表达[15]。Laranjeira等[16]通过检测正常组（16例）与发育不良组（48例）骨髓红系细胞CD117、CD35、CD44表达，提出CD35是CD34+红系前体细胞的早期标志（先于CD105表达），CD44整体表达增加也与该表型相关，以上两种表型改变可能先于细胞形态学发育不良，可辅助用于MDS诊断。此外，Mathis等[17]通过CD36及CD71平均荧光强度系数表达及血红蛋白水平提出红系评分（RED评分）。当RED评分＞3分时，MDS诊断可确立。该评分可协助Ogata评分共同诊断MDS，其灵敏度达88%。

2.3 MDS巨核系的异常细胞免疫表型 由于血小板和巨核细胞享有共同的免疫分型特点以及血小板易于黏附的特性，使标记抗体的特异性表达不高。Stetler-Stevenson等[1]研究发现FCM检测巨核系的异常细胞免疫表型灵敏度低于细胞形态学（60%vs 91%）。因此，FCM检测巨核系异常细胞免疫表型仍比较困难[18]。Sandes等[19]利用FCM检测血小板表面糖蛋白CD31、CD36、CD41a、CD41b、CD42a、CD42b和CD61的表达，发现CD36、CD42a、CD61表达下调为MDS所特有，并建议可通过此方法来评估巨核系异常。此外，2014年Niswander[20]将FCM和细胞形态学成功用于小鼠骨髓分析并由此设想该方法可用于巨核系病态造血评估，仍需进行后续研究证实。

3 FCM多色抗体组合在MDS中的进一步应用研究

2005年荷兰的一个MDS流式细胞工作组通过分析AML的微小残留病灶构建了一个四色抗体组合[21]，2008年该抗体组合被van de Loosdrecht等[22]用于MDS诊断。2012年IMDSFlow推荐了关于分析MDS红系、髓系的最低抗体组合要求[4]，2014年被Prowit等沿用[7]（见表1）。基于此，各个血液病实验室已将抗体组合推广至十色抗体组合。2015年Rajab等[23]结合不同细胞散射特点采用多重设门方法提出了四管十色14种抗体标志（kappa+CD4 FITC、Lambda+CD8 PE、CD3+CD14 ECD、CD34 APC、CD20+CD56 PC7、CD10 APC-A750、CD19APC-A700、CD33 PC5.5、CD5 PB、CD45 KO）用于鉴别血细胞减少患者（具体设门策略见表2）。当患者骨髓原始细胞＜10%，或基于细胞形态学基础未见明显的恶性血液疾病应有的骨髓象表现时，应用筛选抗体组合（见表2）可检测到原始细胞区域（CD45弱表达）的异常B细胞及T细胞；当患者外周血或骨髓原始细胞介于10%～20%，采用管1～3诊断MDS；当原始细胞数≥20%时，在原有设门基础上加用管4检测细胞质标记物以诊断混合表型急性白血病（MPAL）。同时，在此基础上Rajab又提及与MDS相关的四参数流式评分（Ogata评分），该评分已被IMDSFlow推荐[7]，主要包括：增长的CD34+成髓细胞相关细胞群、减低的CD34+B系前体细胞群（CD45和SSC表达相对减低）、CD45+表达异常的成髓细胞群（基于淋巴细胞转为CD45的比例）和下降的中性粒细胞SSC值（基于中性粒细胞转为淋巴细胞的SSC比例）。许多工作组也致力于当前盛行的四参数流式评分[24-25]。然而，2016年Alhan等[26]提出三参数流式评分具有更高的预后评估能力，即SSC低表达、髓系祖细胞CD117高表达及单核细胞上CD13低表达暗示患者总生存率（OS）更低，可进一步细化分析评估MDS预后。

表1 F CM分析MDS骨髓各亚群细胞免疫类型

表2 血细胞减少患者的十色F CM免疫分型

4 流式积分系统在MDS中的研究

2003年Well等[27]指出流式积分系统（FCSS）在鉴别低危MDS和非克隆性血细胞减少患者中具有重要意义。根据FCSS积分可将MDS患者分为低危（正常/轻度异常，0～1分）、中危（中度异常，2～3分）、高危（重度异常，＞4分）。Cremers等[28]曾提出FCSS评估MDS的灵敏度和特异度分别达69%和89%，且FCSS积分＞2分可作为MDS的诊断标准，这在Rajab等[23]实验中也曾被证实。Kern等[29]采用FCM检测了804例疑似MDS患者的骨髓标本，发现FCM异常者的OS较无异常者较低（71.2%vs 89.5%，P＜0.01）。国际预后积分系统（IPSS）及修订后的国际预后评分系统（IPSS-R）是目前使用最广泛的MDS预后评分系统。研究证实FCSS和IPSS之间显著相关[27，30-31]。FCSS可对经IPSS分层的MDS患者进行进一步分层。有研究发现IPSS低危组和高危组、低危组和中危-1组的FCSS积分均有统计学差异（P=0.042、0.018）；IPSS高危组的FCSS积分异常偏高（评分＞4分）；IPSS低危组及中危-1组中也可见异常偏高的FCSS积分[30]。Kern等[29]在其实验中还发现IPSS细胞遗传学核型好的分组中FCM异常者的OS低于FCM正常者（77%vs 90%）。Della等[25]研究中提出当FCSS积分＜2分、=2分及＞2分时，患者的5年OS分别为74%、65%及17%，5年内转化为白血病的风险分别达11%、22%及53%，并指出该积分系统可协助IPSS-R进行预后分析。2014年Alhan等[31]通过研究159例MDS患者的FCSS积分与IPSS、IPSS-R相关性肯定了FCSS积分在MDS中的预后评估价值，该研究提及在IPSS-R低危组中轻度FCM异常者（0～1分）的OS高于中度异常者（2～3分）,具有统计学差异（P=0.05）；轻度异常者疾病转化为RAEB-1或AML的进展速率低于中、重度异常者，但无统计学差异（P=0.24）。此外，Alhan等[31]还认为具有较高FCM异常的IPSS-R低危组患者的预后类似于IPSS-R高危组患者，FCSS积分越高OS越短，该观点在其后期的研究再次被提及[26]。因此，FCSS对IPSS-R的补充使MDS预后分析更精确，是独立于其他已知风险因素的预后预测系统。

5 小结

FCM免疫分型在检测髓系及红系方面有较高的特异度及灵敏度，可作为一项关键性诊断指标列入MDS诊断，但不能作为独立判断MDS的依据。目前临床诊断MDS仍基于临床数据、骨髓细胞形态学、细胞遗传学、流式细胞术、基因测序（SF3B1、TET2、ASXL1、DNMT3A和RUNX1）、克隆性造血检测等手段的综合作用。FCM的研究不仅局限于MDS日常诊断，更能应用于MDS预后评估。关于FCM用于MDS风险评估及治疗方案的选择值得深入研究。

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2016-01-31）

（本文编辑：胥昀）

浙江省医药卫生科研项目（2015KYB264）

310006 杭州，浙江中医药大学第一临床医学院（张帅丹）；浙江中医药大学附属第一医院血液科（郑智茵、胡通林），检验科（刘永林）

郑智茵，E-mail：z05z01y08@ali yu n.com.cn