利用36B4基因扩增效率评价PBMC基因组DNA的制备质量

周丹+++崔晓娴+++孙淑惠++蒋琳+++荣星喻+++汪慧菁+++赵超+++史虹莉

[摘要]目的 建立一种评价PBMC基因组DNA制备质量的简便有效的方法。方法 本研究采用实时定量PCR技术，对样本中的单拷贝基因36B4进行扩增，以考察扩增效率与样品质量之间的关系。结果 经DNase Ⅰ处理的基因组DNA中的36B4扩增效率显著低于未处理样品。采用该方法，对18份健康志愿者的血液标本基因组样品进行检测分析，结果显示，其可以有效地评估血液标本基因组制备质量。结论 该方法可用于评价健康体检标本采集中的流程和操作对体检的影响，提高涉及基因组DNA检测体检项目的准确性。

[关键词]单拷贝基因；基因组DNA；血液标本；定量PCR

[中图分类号] R-331 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）10（a）-0004-04

[Abstract]Objective To establish a simple and effective method for evaluating the preparation quality of the genomic DNA from PBMC.Methods In this study，real-time quantitative PCR technique was used to amplify the single copy gene 36B4 in a sample to investigate the relationship between the amplification efficiency and the quality of samples.Results The amplification efficiency of 36B4 in the genomic DNA treated by DNase Ⅰ was significantly lower than that of the untreated sample.By using this method，the blood samples from 18 healthy volunteers were detected and analyzed，the results showed that the preparation quality of blood sample genome was effectively evaluated.Conclusion The method can be used to evaluate the influence of the process and operation on the physical examination in the sample collection of health examination，and to improve the accuracy of the test item of the genomic DNA.

[Key words]Single-copy gene；Genomic DNA；Blood sample；Quantitative PCR

细胞基因组DNA含有重要的遗传信息，通过检测基因组的DNA序列、拷贝数等信息，可提供细胞遗传和病理的信息，其被广泛应用于遗传病、肿瘤和衰老等诸多领域。随着精准医学的广泛应用，基因组DNA需求也越来越多[1]。制备好的基因组DNA相对较稳定，可长期存放用于相关研究。细胞采集、运输、保存到基因组制备操作过程等多个环节可影响DNA制备的质量，从而可能对后续检测，特别是定量检测结果产生影响。

评估基因组质量可为后续检测提供良好保障，常用的DNA琼脂糖凝胶电泳方法可比较直观地观察DNA的降解情况，但敏感度较差。利用DNA在紫外波长区的吸光度（OD），测定OD260与OD280比值，可以判定DNA的纯度，利用OD260读数，可以较精确地定量DNA含量，但是由OD260的读数计算所得的基因组DNA含量包含了降解的DNA片段，并不能很好地反映基因组的质量。

基因组中含有单拷贝的基因，其与基因组DNA含量有较高的一致性，在基因组降解时，单拷贝的基因也相应降解。通过实时定量PCR技术检测单拷贝基因扩增效率，可以反映基因组降解情况，能够被用来作为评估基因组DNA质量的方法。本研究选取编码酸性核糖体磷酸蛋白PO的36B4基因为目的基因进行扩增[2]，可有效评估制备的基因组DNA的质量。

1材料与方法

1.1全血基因组DNA制备

采用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒（Qiagen公司，Lot No.148030300）抽提EDTA抗凝全血中外周血单核淋巴细胞（PBMC）的基因组DNA，方法见操作说明。简要过程：20 μl蛋白酶K消化液加入溶解于200 μl PBS的PBMC细胞悬液，56℃恒温水浴锅中消化10 min，加入200 μl无水乙醇充分混匀后过柱，再分别用500 μl AW1和AW2洗涤1次，晾干后用100 μl超纯水溶解DNA。

1.2 DNase Ⅰ处理DNA样品

取Takara公司DNA酶Deoxyribonuclease Ⅰ（DNase Ⅰ，Lot No.CE5301A）0.7 U加入1 μg DNA样品，25℃孵育，分别处理1、5、15 min，处理后经Qiagen DNA纯化试剂盒纯化回收。

1.3分光光度仪定量DNA含量

采用Epoch微孔板分光光度计（BioTek公司）对基因组DNA进行定量，并读取OD260/OD280读数，以评估DNA纯度，并对DNA进行定量。

1.4 DNA琼脂糖凝胶电泳

采用1%琼脂糖凝胶电泳，每孔上样量200 ng，条件为100 V恒压，45 min，经复日科技凝胶成像系统成像。采用Takara公司DL5000（M5 kb）、DL15000（M15 kb）DNA marker作为分子量参照。

1.5实时定量PCR检测

PCR体系的组成：150 nmol/L 6-ROX，0.2×Sybr Green Ⅰ，15 nmol/L Tris-HCl（pH=8.0），50 nmol/L KCl，2 mmol/L MgCl2，dNTP各0.2 mmol/L，5 mmol/L DTT，1% DMSO以及1.25 U GoTaq Gold DNA 多聚酶（Promega公司）[3]。基因组DNA模板40 ng，引物浓度0.5 μmol/L，反应体系体积20 μl。反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，58℃延伸1 min（35个循环）。标准曲线为一份抽提的基因组DNA按照梯度稀释，最高浓度42 ng，依次按照1.68倍等比稀释。

引物由生工生物工程上海有限公司合成，序列[4]如下：

36B4u，CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC；

36B4d，CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA。

2结果

2.1琼脂糖凝胶电泳较难分辨降解条带

经DNA酶（DNase Ⅰ）处理的基因组DNA很快被降解成小片段。琼脂糖凝胶电泳图（图1A）可以看到，在同样上样量条件下，基因组DNA主条带含量下降，但并未见到明显的拖尾现象。同样，未被及时处理的抗凝血标本中，也发现在同样上样量条件下，基因组DNA主条带含量下降，而并未见到明显的拖尾现象。原因在于DNA被降解成过小片段，加之凝胶成像分辨率有限，难以被该方法显示出来（图1B）。

M15 kb和M5 kb分别为分子量参照。A中为基因组DNA未经DNase Ⅰ处理和分别处理1 min（D1）、5 min（D5）和15 min（D15）的电泳图。B为同一份血清立刻抽提（G1）、4℃冷藏放置24 h（G2）和室温放置24 h（G3）后抽提的基因组DNA

2.2利用实时定量PCR法扩增标本中的34B4基因可评估DNA质量

借助标准曲线，实时定量PCR法可对样本中的目的基因进行定量，敏感度较高。利用该技术扩增标本中的34B4基因，可以反映出完整的基因组DNA的含量，用此数据能够评估DNA质量高低。对来自同一份健康志愿者的抗凝血在不同条件下抽提，或加DNase Ⅰ处理后，在同样条件下进行扩增，绘制阈值循环数（Ct）-浓度（以2为底的对数值）曲线（图2）。结果显示，立刻抽提组（G1）的扩增效率最高，经DNase Ⅰ处理的基因组DNA的Ct值明显升高（D1和D5），而D15组已不能有效扩增出目的基因。相对于G1组，4℃冷藏放置24 h（G2）和室温放置24 h（G3）后抽提组的Ct值增加，提示扩增效率降低，DNA发生降解。这说明该方法可灵敏地分辨出基因组DNA的降解情况，进而评估DNA质量。

G1、G2、G3、D1、D5和D15组PCR检测起始上样量均为40 ng，Ct值依次升高，D15组未能检测出。横坐标为DNA含量单位纳克（ng），以Log2数值显示，纵坐标为阈值循环数（Ct值）

2.3在实际样本中34B4基因扩增效率反映基因组DNA制备质量

选取18份健康志愿者抗凝血，抽提基因组DNA，利用定量PCR扩增34B4基因，绘制阈值循环数（Ct）-浓度（以2为底的对数值）曲线（图3）。结果显示，13份标本较好地符合标准曲线，5份产生偏离，提示不同的标本基因组DNA质量存在差异。该方法适用于临床实际标本的评估。

3讨论

随着精准医学在健康管理中的应用，越来越多的基因组DNA标本被用于研究[5-7]。基因组的质量受多个环节影响，包括样本采集、运输、储存、后续制备等。对DNA质量进行科学灵敏的评估，能够对样本处理环节的影响进行评价，进而发现影响样本质量的因素，促进样本处理方法的改进，因此，开发简单有效的评估方法显得尤为重要。基因组DNA以双链缠绕组蛋白的形式形成染色体，存在于细胞核内。基因组DNA制备过程中，需裂解细胞膜和细胞核膜，去除蛋白质和RNA干扰[8]。基因组DNA分子量大，易受机械剪切影响，因此，样本取放时应该格外注意[9-10]。基因组DNA样品也受多因素影响，包括储运条件、反复冻融、标本污染等，所以，标准化的流程和全程的管理并配合简便易行的评估手段是保障后续实验成功的必要条件。

单拷贝基因含量在基因组中稳定，与完整的基因组含量成正比。当基因组DNA受损后，单拷贝基因也会随机被降解，导致其扩增效率低于完整基因组DNA。实时定量PCR结果显示，其扩增的Ct值变大[11]。本研究结果显示，长时间放置的抗凝血标本扩增效率降低，而琼脂糖凝胶电泳图中未见明显降解条带，原因是由于后者的分辨率不足。利用DNase Ⅰ处理基因组DNA，作为降解的阳性对照，通过琼脂糖凝胶电泳明显可见DNA降解图形，对应的PCR扩增效率明显降低，并且与凝胶结果正相关，这说明该方法是一种灵敏可靠的评估DNA降解的方法。目前常用的可供选择的单拷贝基因有36B4、β-globin等[12-13]。本研究也发现利用不同单拷贝基因扩增对应的评估效果类似。

实时定量PCR法用于目的基因的扩增，具有线性范围广、重复性好、易于批量化等优点，适合在临床科室中推广应用。目前，很多医院检验科和中心实验室已经配备实时定量PCR仪，所以该方法的可移植性好。而其缺点同一般PCR（如易污染，过于灵敏）类似，但可以通过严格规范操作程序和采用复孔等方法避免[14]。

本方法可以作为评估基因组DNA质量的简单可靠的方法，具有便捷可靠的特点，易于在健康管理和临床实践中推广使用，特别是对基因组DNA质量要求较高的研究，如基因拷贝数、端粒检测等[15-16]。

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（收稿日期：2016-07-19 本文编辑：祁海文）