壳寡糖添加量对青鱼幼鱼血清特定生化指标、肝和肠白介素IL-2、IL-8和IL-10 mRNA表达量的影响

许友卿，高 巍，刘富娟，丁兆坤

( 广西大学 水产科学研究所，广西高校水生生物健康养殖与营养调控重点实验室，广西大学 动物科学科技学院，广西 南宁 530004 )

壳寡糖添加量对青鱼幼鱼血清特定生化指标、肝和肠白介素IL-2、IL-8和IL-10 mRNA表达量的影响

许友卿，高 巍，刘富娟，丁兆坤

( 广西大学 水产科学研究所，广西高校水生生物健康养殖与营养调控重点实验室，广西大学 动物科学科技学院，广西 南宁 530004 )

将30日龄、体质量约4.7 g的青鱼放养在12个网箱中，每箱40尾，分别投喂添加0(对照组)、0.3%、0.6%和1.2%壳寡糖的饲料50 d，每种饲料3个重复，研究壳寡糖添加量对青鱼血清特定生化指标、肝和肠白介素-2(IL-2)、白介素-8(IL-8)和白介素-10(IL-10 ) mRNA表达量的影响。试验结果显示，与对照组比较，0.3%壳寡糖组青鱼血清乳酸脱氢酶的活性显著降低(P<0.05)，0.6%壳寡糖组青鱼血清甘油三酯、葡萄糖的含量和乳酸脱氢酶的活性显著降低(P<0.05)，0.3%组的肝IL-2和IL-10的表达量显著提高(P<0.05)，0.6%壳寡糖组的肝IL-2和IL-8的表达量显著提高(P<0.05)。试验结果表明，在饲料中添加壳寡糖能促进青鱼幼鱼肝和肠白介素的表达，增强免疫力，降低血糖血脂含量，其中以添加0.6%壳寡糖的效果最佳。

壳寡糖；白介素；表达；幼鱼；青鱼

白介素(全称白细胞介素，Interleukin, IL)是指在白细胞或免疫细胞间相互作用的淋巴因子，由淋巴细胞、巨噬细胞等产生，能刺激T、B淋巴细胞及其他参与免疫反应的细胞增殖、分化，提高其功能。白介素和血细胞生长因子同属细胞因子。两者相互协调，相互作用，共同完成造血和免疫调节功能。白介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及炎症反应中起重要作用。至1994年已发现了15种白介素，其中IL-2、IL-8和IL-10是主要成员，发挥重要的生理作用[1-2]。研究表明，血清中的酶、糖、脂肪等水平与机体健康和功能密切相关。

壳寡糖可以促进动物生长、提高免疫力、降血脂、抗菌、抗炎和抗癌等[3-5]。在饲料中添加适量壳寡糖可以显著提高吉富罗非鱼(GIFT，Oreochromisniloticus)幼鱼的生长速度和抗嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)感染的能力[6]。壳寡糖添加剂可以不同程度地提高三疣梭子蟹 (Portunustrituberculatus)血淋巴的过氧化物酶活性等[7]。用壳寡糖添加剂饲喂的肉鸡血液中免疫球蛋白数量增加，提高了肉鸡的免疫力[8]。壳寡糖还能降血糖，且无毒副作用，是一种无污染、无残留的饲料添加剂[9]。但是，少见壳寡糖对青鱼(Mylopharyngodonpiceus)幼鱼作用的研究。

本试验研究了在饲料中添加壳寡糖对青鱼幼鱼血清乳酸脱氢酶活性、甘油三酯和葡萄糖含量及肝和肠IL-2、IL-8和IL-10 mRNA表达的影响，以其为青鱼健康养殖提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验鱼是湖南农业大学培育的23日龄青鱼稚鱼800尾，用基础饲料驯化投喂1周后，挑选机体健康、规格一致的30 日龄、体质量约4.7 g的鱼560尾，随机取其中80尾作0周样品，其余随机分为4组，每组3个重复，放入12个正方体1 m×1 m×1 m网箱，每箱40尾。

不加壳寡糖，仅为基础饲料的为对照饲料；试验饲料是基础饲料分别添加0.3%、0.6%和1.2%壳寡糖(表1)。壳寡糖购自大连中科格莱克生物科技有限公司，平均分子量小于1000，聚合度2～7，颗粒度≥100目，水分少于10%，灰分少于1%，pH 5.5～7.0。

粉碎和混匀的原料经60目过筛后，用小型商用制粒机制成粒径1.5 mm、长约2 cm的柱状颗粒，60 °C烘干密封备用。

表1 基础饲料组成及营养水平(以干饲料计算)

注：预混料(mg/kg)：氯化钾，200 mg；碘化钾(1%)，60 mg；六水氯化钴(1%)，50 mg；五水硫酸铜，30 mg；一水硫酸亚铁，400 mg；一水硫酸锌，400 mg；一水硫酸锰，150 mg；五水亚硒酸纳(1%)，65 mg；一水硫酸镁，2000 mg；沸石粉，3645.85 mg；维生素B1，12 mg；核黄素，12 mg；维生素B6(盐酸吡哆醇)，8 mg；维生素B12，0.05 mg；维生素K3，8 mg；肌醇，100 mg；泛酸钙(维生素B3)，40 mg；烟酸，50 mg；叶酸，5 mg；生物素，0.8 mg；维生素A，25 mg；维生素D3，5 mg；乙氧基喹啉，150 mg；小麦粉，2584.15 mg.

1.2 饲养管理

试验用水库水，pH 7.2～7.5，溶氧量>5 mg/L。每日9:00、15:00各投喂一次，日投喂量为鱼体总质量的3%，饲养50 d。

1.3 测定项目与方法

试验结束时，每个网箱随机取8尾鱼，用1∶13 000的间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐麻醉，分别从尾静脉采血，血液于室温静止4 h后，用3800 g低温离心12 min，分别取血清装于PC样品瓶中，标记牢固，用液氮速冻后，移存于-80 °C中作测定用。将取血后的青鱼肠、肝脏取出，用0.65%的生理盐水清洗干净，用锡箔纸包好，标记牢固，用液氮速冻，移存于-80 °C待测定。

血清甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、葡萄糖、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶等生化指标，用南京建成生物工程研究所制备的试剂盒和全自动生化分析仪(深圳迈瑞BS-190全自动生化分析仪)测定。

肝脏和肠免疫因子IL-2、IL-8和IL-10 mRNA的表达量用下述方法测定：先用Trizol试剂(Invitrogen, CA, USA)提取样品中的总RNA，用TAKARA试剂盒反转录，用SYBR-Green Ⅰ染料法，用Thermo试剂盒进行实时荧光定量(RTQ-PCR)，所使用的TRQ-PCR仪为ABI荧光定量PCR仪(9700系统)。

引物设计：用Primer Premier 5.0(Premier Biosoft International, Palo Alto, CA)设计引物，由上海生工生物公司合成。目的基因及内参基因见表2。

表2 免疫相关基因的引物设计

1.4 数据处理与统计分析

所有数据均采用SPSS 21.0单因素Duncan法分析，以平均值±标准差表示，差异显著表示为P<0.05。

2 结 果

2.1 壳寡糖的添加量对青鱼幼鱼血清生化特定指标的影响

添加0.6%壳寡糖组鱼血清甘油三酯含量[(1.76±0.05) mmol/L]显著低于对照组[(1.97±0.10) mmol/L](P<0.05)，添加0.3%、1.2%壳寡糖组鱼血清甘油三酯含量[(1.87±0.01 ) mmol/L和(1.84±0.04) mmol/L]与对照组差异不显著(P>0.05)；添加0.6%壳寡糖组鱼血清葡萄糖含量[(6.08±0.22) mmol/L]显著低于对照组[(7.67 ± 0.33 ) mmol/L](P<0.05)，添加0.3%、1.2%壳寡糖组鱼血清葡萄糖含量[分别为(6.98 ± 0.44) mmol/L和(6.78±0.13 ) mmol/L]与对照组差异不显著(P>0.05)；添加0.3%和0.6%壳寡糖组鱼血清乳酸脱氢酶[分别为(536.80±13.84) U/L和(412.10±21.79 ) U/L]显著低于对照组[(715.23±80.88) U/L](P<0.05)，但1.2%壳寡糖组鱼血清乳酸脱氢酶[(689.17±10.98 ) U/L]与对照组差异不显著(P>0.05)；添加不同剂量的壳寡糖，对青鱼幼鱼总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白的含量以及谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性的影响均不显著(P>0.05)(表3)。

表3 壳寡糖添加量对青鱼幼鱼血清特定生化指标的影响

注：上述所有数据均为平均数±标准差(n = 3×3). 同行数据上标不同字母者表示数据间差异显著(P< 0.05).

2.2 壳寡糖的添加量对青鱼幼鱼肠和肝IL-2、IL-8和IL-10 mRNA表达量的影响

添加0.6%壳寡糖组鱼肝IL-2 mRNA的表达量显著高于对照组和添加0.3%、1.2%壳寡糖组(P<0.05)，添加0.3%和0.6%壳寡糖组鱼肝IL-2 mRNA的表达量显著高于对照组(P<0.05)，但添加1.2%壳寡糖组鱼肝IL-2 mRNA的表达量与对照组差异不显著(P>0.05)；添加0.6%壳寡糖组鱼肠IL-2 mRNA的表达量显著高于1.2%壳寡糖组(P<0.05)，但与0.3%组差异不显著(P>0.05)，添加0.6%壳寡糖组鱼肠IL-2 mRNA的表达量显著高于对照组(P<0.05)，但添加0.3%、1.2%壳寡糖组鱼肠IL-2 mRNA的表达量与对照组差异不显著(P>0.05)(图1)。

添加0.6%壳寡糖组鱼肝IL-8 mRNA的表达量显著高于对照组(P<0.05)，添加0.3%、1.2%壳寡糖组鱼肝IL-8 mRNA的表达量与对照组差异不显著(P>0.05)，且添加0.6%壳寡糖组鱼肝IL-8 mRNA的表达量显著高于0.3%壳寡糖组(P<0.05)；各组鱼肠IL-8 mRNA的表达量彼此差异不显著(P>0.05)(图1)。

添加0.3%壳寡糖组鱼肝IL-10 mRNA的表达量显著高于添加0.6%、1.2%壳寡糖组(P<0.05)，添加0.3%壳寡糖组鱼肝IL-10 mRNA的表达量显著高于对照组(P<0.05)，但添加0.6%、1.2%壳寡糖鱼肝IL-10 mRNA的表达量与对照组差异不显著(P>0.05)；添加0.6%壳寡糖组鱼肠IL-10 mRNA的表达量显著高于对照组、添加0.3%和1.2%组(P<0.05)(图1)。

对照组 0.3%壳寡糖组 0.6%壳寡糖组 1.2%壳寡糖组

3 讨 论

研究发现，0.6%壳寡糖添加剂能显著促进青鱼幼鱼肝和肠IL-2、IL-8和IL-10 m RNA的表达。笔者认为，促炎症因子IL-2、IL-8和抗炎症因子IL-10的表达同时提高，可有效提升机体的抗炎水平，并不会对机体产生不利因素，其理由是：IL-2是T细胞生长因子，可促进T细胞免疫反应，能活化T细胞和巨噬细胞的表达[10]，促进多种细胞反应，促进淋巴因子激活的杀伤细胞分化和分泌免疫球蛋白(Ig)[11]。IL-8是典型的促炎症因子，也是一种重要的趋化因子，还有很强的促血管生成作用。IL-8调节炎症反应，对感染组织有一定的恢复作用[12]。IL-10具有抗炎、抗肿瘤作用[13-14]，参与炎症反应并能缓解炎症，对机体具有保护作用，在硬骨鱼中具有免疫调节作用[15]。IL-10 mRNA的表达增加可抑制炎症反应，缓解炎症疾病，有助于治疗炎症[15-16]。

本研究表明，添加0.3%和0.6%的壳寡糖显著降低了青鱼幼鱼血清中乳酸脱氢酶的活性。该酶活性的降低有利于保护青鱼机体组织，维持乳酸脱氢酶平衡。用中药降低球虫感染雏鸡血清乳酸脱氢酶活性，具有保护肠道黏膜，降低其受损程度的作用[17]。

研究表明，饲料中添加0.6%的壳寡糖能显著降低青鱼幼鱼血清中甘油三酯的含量。血清甘油三酯降低使血脂减少，有益于心血管健康和发挥生理功能。试验结果与孙立威等[6，18]研究结果一致，孙立威等[6]在日粮中添加适量的壳寡糖可以显著降低吉富罗非鱼幼鱼血清中总胆固醇和低密度脂蛋白水平。刘含亮等[18]在饲料中添加壳寡糖显著降低了虹鳟(Oncorhynchusmykiss)血清甘油三酯和胆固醇等含量(P> 0.05)。

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EffectofChito-oligosaccharideonSerumBiochemicalIndicesandExpressionofIL-2,IL-8andIL-10mRNAinJuvenileBlackCarpMylopharyngodonpiceus

XU Youqing, GAO Wei, LIU Fujuan, DING Zhaokun

( Key Laboratory for Aquaculture and Nutritional Control of Living Organism in Guangxi High Education, Institute for Fishery Sciences, Faculty of Animal Sciences and Technology, Guangxi University, Nanning 530004, China )

A total of 560 30 day old black carp (Mylopharyngodonpiceus) juveniles with body weight of about 4.7 g acclimatized for 1 week were reared in 12 net cages each of 1 m×1 m×1 m at a rate of 40 fish per cage and fed 4 diets containing 0 (control group), 0.3%, 0.6% and 1.2% of chito-oligosaccharide twice a day at a rate of 3% of total fish body weight with triplication for 50 days to study the effects of chito-oligosaccharide on specific biochemical indices in the serum and the expression of IL-2, IL-8 and IL-10 mRNA in hepatopancreas and intestine of the juvenile. The lactate dehydrogenase activity was found to be decreased significantly in the fish fed 0.3% chito-oligosaccharide(P<0.05). The levels of triglycerides and glucose and activity of lactate dehydrogenase were found to be significantly reduced in the fish fed 0.6% chito-oligosaccharide (P<0.05). The expression of IL-2 and IL-10 mRNA was found to be increased significantly in the hepatopancreas of the fish fed 0.3% chito-oligosaccaride(P<0.05). The expression of IL-2 and IL-8 mRNA was found to be increased significantly in the hepatopancreas of the fish fed 0.6% chito-oligosaccharide(P<0.05). The expression of IL-2 and IL-10 mRNA was found to be increased significantly in the intestine of the fish fed 0.6% chito-oligosaccharide(P< 0.05). It is concluded that chito-oligosaccharide supplementation significantly decreases blood glucose and lipid levels, and significantly promotes the expression of interleukin in the hepatopancreas and intestine of juvenile black carp. It is suggested that the optimal dietary supplementation of chito-oligosaccharide be 0.6%.

chito-oligosaccharide; interleukin; expression; juvenile;Mylopharyngodonpiceus

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.02.011

S963.73

A

1003-1111(2016)02-0157-05

2015-08-28；

2015-10-26.

国家自然科学基金资助项目(31360639); 广西壮族自治区生物学博士点建设项目(P11900116, P11900117); 广西自然科学基金资助项目(2012GXNSFAA053182, 2013GXNSFAA019274, 2014GXNSFAA118286, 2014GXNSFAA118292); 广西科技项目(1298007-3).

许友卿(1958-)，女, 教授, 博士生导师；研究方向：环境生物学、水生动物营养、生理、生化和分子生物学. E-mail: youqing.xu@hotmail.com. 通讯作者: 丁兆坤(1956-)，男，教授, 博士生导师；研究方向：环境生物学、水生动物营养、生理、生化和分子生物学. E-mail: zhaokun.ding@hotmail.com.