中华鳖源嗜水气单胞菌的研究进展

郑杰夫，张一柳，钟 蕾

( 湖南农业大学 动物科学技术学院，湖南 长沙 410128 )

中华鳖源嗜水气单胞菌的研究进展

郑杰夫，张一柳，钟 蕾

( 湖南农业大学 动物科学技术学院，湖南 长沙 410128 )

中华鳖；嗜水气单胞菌；生物学特性；疾病；防治

中华鳖(Trionyxsinensis)肉质鲜美，营养丰富，是我国珍贵的淡水名特优水产动物之一。我国中华鳖产量一直居世界产量之首。但近几年中华鳖病原性疾病大量爆发，给我国龟鳖养殖业造成了重大损失。在已经报道的25种中华鳌疾病中，由嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)引起的有15种，如红脖子病、腮腺炎病、红底板病、白底板病、腐皮病、疖疮病、穿孔病、烂甲病等[1]。笔者系统总结了中华鳖源嗜水气单胞菌的生物学特征、主要疾病及其防治研究进展，以期为中华鳖源嗜水气单胞菌病的防治提供参考。

1 嗜水气单胞菌的生物学特性

嗜水气单胞菌为两端钝圆，直形或略弯的短杆状革兰氏阴性菌。细胞成单或成双排列，无芽孢和荚膜。液体培养均呈一端单鞭毛，经分离纯化，在普通琼脂上37 ℃，24 h培养出现的菌落为圆形、灰白、半透明、表面光滑、湿润、菌苔很薄、圆整[1]。近几年许多学者从不同的患病水产动物中分离到了嗜水气单胞菌[2-4]，其中不乏有鳖源嗜水气单胞菌，并且研究了其有关耐药性和致病性以及相关分子生物学特性。

1.1 耐药性

细菌的耐药性分为天然耐药性和获得耐药性，可由染色体介导即染色体基因选择性突变和质粒介导即获得外源耐药基因，或由二者共同介导产生对抗生素的耐药性[5-6]。嗜水气单胞菌为适应外界环境的变化，特别是抗生素的普遍使用，耐药性日趋严重[7]。研究表明，嗜水气单胞菌对大部分抗生素存在多重耐药性。Jonggareanjai等[8]分离了27株鱼源致病菌，66.3%对抗生素有耐药性，其中对阿莫西林、青霉素和甲硝唑耐药率分别为92.3%、92.3%和100%。Vivekanandhan等[9]发现，319株嗜水气单胞菌对卡那霉素和万古霉素的耐药率大于80%，对多黏菌素、新生霉素和新菌素B的耐药率大于90%，对利福平和甲氧西林的耐药率为100%。Kaskhedikar等[10]研究了鱼源嗜水气单胞菌分离株对青霉素类和多粘菌素类的耐药性。

嗜水气单胞菌对结构近似或作用性质相同的同类抗生素具有交叉耐药性。蔡丽娟等[11-12]研究分析嗜水气单胞菌对几种同类抗生素的耐药性，发现该菌对四环素和强力霉素、四环素类和氟喹诺酮类药物存在交叉耐药。

不同时间和地域的嗜水气单胞菌分离株的耐药性差异较大。宋铁英等[13]不同时期从俄罗斯及国内各地分离、收集的40株嗜水气单胞菌，9种抗菌素的药敏试验结果显示，菌株的耐药强度与原分离地是否使用抗菌素高度相关。

1.2 致病性

目前国内外报道的致病性嗜水气单胞菌的主要毒力因子有外毒素、胞外蛋白酶、黏附因子(S蛋白、菌毛、外膜蛋白、脂多糖)等。其中外毒素是重要的致病因子之一，包括气溶素[14]、溶血素[15-16]、细胞毒素[17]、肠毒素[18]、HEC毒素[19]等。其中HEC毒素是兼有细胞毒性、溶血性和肠毒性的外毒素。毒力因子在细菌的致病过程中起重要作用，而且各毒力因子对机体致病作用相互协同[20-21]。

国内学者对中华鳖源嗜水气单胞菌致病力的研究较国外多。王津津[22]将1.5×108、1.5×109、1.5×1010cfu/mL 3个密度梯度的嗜水气单胞菌T0608菌株分别感染中华鳖，并从濒死的中华鳖中分离该细菌，证明该菌株是中华鳖患病的致病菌株，半数致死密度为1.5×108cfu/mL。刘凯等[23]从中华鳖肝脏中分离获得嗜水气单胞菌ARC090812菌株，半数致死密度为7.87×108cfu/mL。杨先乐等[24]用嗜水气单胞菌T3和40142G菌株感染中华鳖，在约28 ℃时，半数致死密度分别为5.60×105cfu/g与1.00 ×106cfu/g。邱德全等[25]从患红脖子病的中华鳖中分离的嗜水气单胞菌，腹腔注射在7 d内的半数致死密度为1.18×107cfu/g。王志铮等[26]从患白底板病的中华鳖内脏中分离出4株致病性嗜水气单胞菌，其致死力依次为ZHYYZ-2>ZHYYZ-4>ZHYYZ-1>ZHYYZ-3;使用ZHYYZ-1注射攻毒稚鳖，表明半数致死密度为8.8×104cfu/g，注射入稚鳖体内的可控安全菌含量为1.2×103～8.8×103cfu/g[27-28]。

1.3 分子生物学研究进展

中华鳖等龟鳖类分子生物学研究远落后于鸟类及哺乳类，其免疫学研究不及鱼类和两栖类，但近年来逐渐受到重视。李伟等[29]将致病性嗜水气单胞菌人工感染中华鳖，并从病鳖的心、肝、脾、肾中分离获得嗜水气单胞菌Z22菌株，应用SMART技术构建了嗜水气单胞菌感染中华鳖相关组织的cDNA 文库。周秀霞等[30]应用抑制性差减杂交技术，构建了致病性嗜水气单胞菌感染中华鳖肝、脾、肾组织的差减cDNA文库。李肖梁等[31-32]成功克隆了中华鳖tMyD88、tHse70、tGRP78和tHsp72基因，其中MyD88分子可能具有类似哺乳动物MyD88的生物学活性，后三者基因转录表达产物为参与机体应激反应的热休克蛋白。Zhou等[33]利用差减杂交技术研究了人工感染嗜水气单胞菌的中华鳖的差异表达基因，通过实时Northern杂交和RT-PCR分析进一步观察到42个差异表达基因中，有6个基因：IL-8、血清淀粉样蛋白、CD9、CD59、激活转录因子4和组织蛋白酶L基因，在受感染的中华鳖中含量上升。这些cDNA文库和免疫相关基因的建立，为快速分离和克隆中华鳖与嗜水气单胞菌感染相关的免疫基因及从分子水平探讨中华鳖的病理和抗感染免疫机制奠定了基础。

邓先余等[34]测定了从患“红底板病”的中华鳖体内分离到的一株嗜水气单胞菌的16S～23S rDNA IGS序列，并将得到的2个片段与其他属种的相应序列进行比较，设计出对嗜水气单胞菌特异的PCR引物，建立了检测嗜水气单胞菌的PCR方法，探讨了其灵敏性和特异性。黄晓等[35]从患“红底板病”的中华鳖分离的嗜水气单胞菌中扩增获得了ompTS基因，推测该基因为编码38.9 ku的嗜水气单胞菌外膜蛋白OmpTS的一个新基因，并且蛋白质OmpTS在膜中极有可能形成孔道，具备与孔蛋白类似的性质。目前采用16S rDNA序列分析技术构建中华鳖共附生细菌克隆文库的报道较少[36]，而用于对养殖环境中微生物群落的分析和鉴定已经分离培养的病原菌的报道较多。王志铮等[26]经Blast同源性检索表明，4株嗜水气单胞菌ZHYYZ-1、ZHYYZ-2、ZHYYZ-3、ZHYYZ-4所扩增的16S rDNA序列与GenBank数据库中登记的71株嗜水气单胞菌的相似性均为99%。经PCR特异性检测，4株菌均拥有Aha、AHH、AerA和OMP 4个毒力基因相应的基因片段。罗方兴[37]利用16S rDNA序列分析技术构建了嗜水气单胞菌A2012-1菌株的系统发育树。

经典的遗传育种研究方法往往无法确定重要性状的具体控制基因。王金锋等[38]利用近年发展起来的新型分子标记系统——相关序列扩增多态性标记技术扩增了人工感染中华鳖的嗜水气单胞菌感病群体和抗病群体，结果显示2个群体中有6 条多态性带差异极大，其中的2条带为抗病群体出现高显性基因频率的标记，并且认为这些标记很可能是与抗病性相关的候选标记。

Xu等[39]将免疫球蛋白M、免疫球蛋白D和免疫球蛋白Y跨接中华鳖，通过实时荧光定量PCR分析，揭示了在中华鳖的初级和次级抗体反应模式；还将免疫球蛋白导入J链再接种至中华鳖，通过采用实时定量RT-PCR分析，可以在注射灭活嗜水气单胞菌的中华鳖的脾、肾和血液里观察到J链显著增加，证明J链可以在细菌感染中起免疫作用[40]。Psil-8(m)和Psil-8的成功表达及其趋化活性的成功检测，从非特异性免疫方面为防治中华鳖病原性疾病奠定了基础[41]。

2 中华鳖源嗜水气单胞菌疾病

嗜水气单胞菌是中华鳖的主要致病菌。目前已从多种鳖病中分离到该病菌(表1)。由表1可见，嗜水气单胞菌可引起中华鳖多种细菌性疾病，如红脖子病[42-44]、红底板病[45-46]、白底板病[28,46-48]、腐皮病[37,49-52]、疖疮病(穿孔病、烂甲病)[49,53-54]、出血性肠道坏死病[53,55]和出血性肠炎[56]等多种不同症状的疾病，即一病多症。嗜水气单胞菌还可以产生多种并发症，如“腐皮、疖疮”并发症[49,55]，“红脖子、红底板”并发症[42]，“红底板、白底板”并发症[46,48]等。调查发现，中华鳖在患其中一种病后，会继发感染其他类型的疾病。可见中华鳖疾病具有并发性而很难有效治疗[49]。

表1 嗜水气单胞菌引起的中华鳖主要疾病

在中华鳖疾病中，同病异名的混乱现象普遍存在。穿孔病病原是以嗜水气单胞菌为主的多种病原菌。叶巧真等[66]根据对疖疮病、穿孔病和烂甲病症状的描述，将其归属于同一疾病。疖疮是烂甲和穿孔的必经过程和进一步恶化，但是大多数病鳖尚未达到穿孔、烂甲的程度就已经死亡。程天印[67]指出，不同作者对红脖子病、败血病、赤斑病和嗜水气单胞菌病等病症的文字描述大同小异，鉴定出的致病菌均为嗜水气单胞菌，因此认为这些疾病很可能是同一种疾病。陆宏达等[68]则建议将“红脖子病”和“鳖赤斑病”统一命名为“嗜水气单胞菌败血症”，以更客观地反映病鳖病变的本质，避免同病异名的混乱现象。

3 中华鳖嗜水气单胞菌的防治研究进展

3.1 用抗生素防治中华鳖嗜水气单胞菌疾病的研究

抗生素是防治中华鳖细菌性疾病的主要药物。研究表明，不同区域的嗜水气单胞菌对药物的敏感性以及敏感程度不同。药敏试验表明，环丙沙星、氯霉素、庆大霉素和红霉素对嗜水气单胞菌都有极强的抗菌性[65]，其中氯霉素、环丙沙星、红霉素为无公害水产品生产中的禁用渔药[69]，禁止在中华鳖养殖中使用。赵小平等[70]的药敏试验结果表明，嗜水气单胞菌对氧氟沙星、恩诺沙星、丁胺卡那霉素高度敏感。吴惠仙等[56-57]对致使中华鳖患腐皮病的1株嗜水气单胞菌和患疖疮穿孔病的6株嗜水气单胞菌分别进行了药敏试验。结果表明，庆大霉素、新霉素、呋喃妥因、氟嗪酸和丁胺卡那等抗生素对AG9610、JS967、GZ964、LA979、CG9611和TG985等6菌株的抑菌直径绝大部分大于15 mm(新霉素和丁胺卡那对CG9611抑菌直径小于15 mm)。罗方兴等[37,54-55]自患“腐皮、疖疮”并发症和腐皮病的中华鳖中分离嗜水气单胞菌 Z2012-1、A2012-1和A2012-2，结合药敏试验表明，以上3株菌对庆大霉素、复方新诺明、氯霉素等药物均高度敏感。

3.2 中华鳖嗜水气单胞菌的免疫防治研究

采用疫苗免疫是解决中华鳖疾病的有效途径之一。多直接利用注射疫苗免疫嗜水气单胞菌，如灭活疫苗[71]、免疫血清[72]和亚单位疫苗[73]，也有将包含多种嗜水气单胞菌毒力因子的生物膜[74-75]、外膜蛋白[76]、粗脂多糖[77]收集起来，作为抗原注射试验动物，都具有良好的免疫保护效应。但是注射免疫工作量较大，注射伤口易感染，易引起机体的应激反应。余为一等[78]用灭活的嗜水气单胞菌浸泡方法免疫幼鳖，陈强等[79-80]用抗嗜水气单胞菌的卵黄抗体浸泡、口腔喷注中华鳖，其免疫效果不够理想，因为浸泡方式一般要求稚鳖，浸泡浓度和口服饲料所含卵黄抗体量达到一定水平才具有较好的免疫作用。张乐祎[41]在烟草叶片细胞中成功瞬时表达嗜水气单胞菌HBNUAh01外膜蛋白A基因，为进一步研发抗嗜水气单胞菌植物性可食疫苗奠定了基础。钱明明等[81-83]采用生物可降解高分子材料PLGA，用W/O/W法制备口服缓释微球，结合免疫应答和攻毒试验，分别表明了中华鳖口服缓释微球疫苗免疫的持续性长和有效性强，认为该方法可作为控制中华鳖嗜水气单胞菌病的一种免疫防治新途径。

某些药物，如固氮细菌属(868细菌)的多糖类提取物和左旋咪唑等，能够提高抗嗜水气单胞菌特异性抗体效价，具有免疫增强效果[84]。郝贵杰等[50]试验表明，不同佐剂的免疫效果依次为：弗氏佐剂>白油佐剂>蜂胶佐剂>不加佐剂，但综合分析最佳免疫佐剂为蜂胶佐剂。

3.3 用中草药防治中华鳖嗜水气单胞菌的研究

随着抗生素残留及耐药性问题的突出及人们对食品安全的重视，不得不减少对抗生素和化学药品的依赖，寻找替代抗生素的药品。中草药源于动植物和矿物，具有天然性、无抗药性、低毒低残留以及多种功能的特点[85-86]。

目前对抗菌类中草药的研究较充分。喻运珍等[87]测定了五倍子、穿心莲、连翘等53种中草药对患红底板、粗脖子病中华鳖嗜水气单胞菌C-961203的最小抑菌浓度。结果表明,五倍子、连翘、穿心莲、杜丹皮、诃子、青蒿、秦皮、乌梅、五味子和鱼腥草的最小抑菌含量均小于15.6 μL/mL。郭秀平等[88]测定45种中草药提取物对患败血症中华鳖源嗜水气单胞菌A1421的体外抑菌作用。结果显示，夏枯草、地榆、诃子、黄芩、赤芍、牡丹皮的抑菌直径大于10 mm；丁香、夏枯草、地榆的最小杀菌质量浓度均为7.81 mg/mL。吴惠仙[89]测定了15种中草药对患疖疮穿孔病中华鳖嗜水气单胞菌JS967的拮抗作用，结果显示，地锦草和五倍子的抑菌直径分别为12.5、16.8 mm，菌株敏感度分别为中度敏感、高度敏感。赵蓓蓓[28]测定了10种中草药对患白底板病中华鳖嗜水气单胞菌ZHYYZ -1菌株的体外抑菌效果，结果显示当菌液密度为1.0×107cfu/mL时，蒲公英、黄芩、金银花、五倍子的最小抑菌质量浓度分别为12.50、3.12、6.25、0.78 mg/mL。某些中草药，如甘草素，不仅具有提高供试中华鳖免疫应答水平，改善肝功能，增强抗嗜水气单胞菌感染的能力，还具有明显的促生长作用[90]。

综上所述，各研究的中草药抑菌效果不尽相同，但总体差异不大，其中无药残、副作用较小的五倍子较佳。试验结果不同的因素许多，其中主要有中草药体外抑菌试验方法、嗜水气单胞菌菌株类型和中草药之间的拮抗协同作用。在生产中利用不同中草药复方组合、不同复方组合之间交替使用[28]，可以更好地发挥中药的抑菌作用。

3.4 中华鳖嗜水气单胞菌的噬菌体防治研究

随着人们对绿色健康的要求增高，生物防治也受到人们的重视，其中噬菌体治疗以其专一性强、生态环保、无残留等优势受到人们亲睐[91-92]。林业杰等[93]首次分离获得了6株嗜水气单胞菌噬菌体，其增殖效价可达108～109pfu/mL，其裂解力较强，多为增殖性裂解反应，而不是“抑菌”现象。但该噬菌体对环境要求较高，过酸、高温、紫外辐射均可使其失活，而且噬菌体吸附宿主菌的时间比较长，在这段时间内可能引起的变量也将影响噬菌体治疗的总体效果。在将噬菌体正式应用于治疗中华鳖细菌性疾病之前，仍需进行大量的研究，改善其对生存环境的苛刻[94]。

3.5 其他防治研究

在中华鳖温室养殖中，与嗜水气单胞菌病发生相关的主要环境因子有温度、溶解氧、pH、氨氮、生物因子和亚硝酸氮等[95]。张磊[65]监测了养殖水体的化学指标，表明中华鳖的患病情况与总氮、氨氮含量的变化相一致。春季温室鳖种转入外塘养殖发病率超过全年发病率的80%，抓住平时预防与早期确诊治疗是控制疾病的关键[96]。嗜水气单胞菌是条件性致病菌，该病的发生是鳖、致病菌和水环境因素综合作用的结果，其中水环境因素最具多变性，是决定疾病发生和发展的重要外部因素。因此，防治中华鳖疾病先是改善水质，浮床栽培空心菜以及套养清道夫鱼类对养殖水体化学指标有较好的控制作用[83]。采用微生态制剂可以改善水体中的微生态。吴惠仙[97]分离获得了7株具有抗嗜水气单胞菌的芽孢杆菌菌株，对中华鳖有良好的保护作用。张棋等[98]在中华鳖肠道中发现一株潜在益生菌——屎肠球菌(Enterococcusfaecium)。结合适量补充外源性谷氨酰胺能促进中华鳖肠道有益菌的定殖，利于肝脏、肠道与脾脏结构和功能的恢复，提高成活率[99]。

目前有关中华鳖疾病防治的物理防治研究甚少。金宏等[100]认为，用紫外线可杀灭中华鳖体表或饲养用水的病原菌。Zhang等[101]研究发现，当温度急剧下降时，没有抑制中华鳖对抗细菌的免疫功能，相反，至少在急性冷应激处理后很短的时间内，甚至可能增加各种促炎细胞因子的表达。因此对中华鳖进行急性冷应激处理能作为一种物理防治手段。

4 展 望

目前对鳖病的研究还处于基础阶段，有很多疾病还缺乏研究或研究薄弱：病原的分离方法与技术落后；缺乏基本的生理参数；滥用化学药物或盲目加大药物，特别是抗生素的剂量[102]。在中华鳖的疾病防治上应注重以防为主，防重于治，防治结合的理念，切实执行“三消”(池塘、工具及食场和鳖体消毒)和“四定”(定时、定位、定质、定量)的预防措施。

需要指出的是，由于中华鳖疾病存在一病多症、一症多病的特点以及同病异名的混乱现象，鳖病的名称缺乏统一规范，阻碍鳖病诊断，而成功、有效地防治依赖于对病原的正确诊断。笔者根据鳖病中的一病多症，尤以嗜水气单胞菌引起的中华鳖细菌性疾病，查阅近十几年的相关文献，归纳总结了鳖源嗜水气单胞菌的防治研究进展，为今后防治嗜水气单胞菌引起的中华鳖疾病提供参考。

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ResearchAdvancesonDiseasesofAeromonashydrophilainChineseSoft-shelledTurtleTrionyxsinensis

ZHENG Jiefu， ZHANG Yiliu， ZHONG Lei

( 1.College of Animal Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China )

Trionyxsinensis;Aeromonashydrophila; biological characteristics; disease; prevention and control

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.02.017

S947.1

C

1003-1111(2016)02-0191-08

2015-05-18；

2015-08-03.

农业部渔用药物创制重点实验室开放课题(201403).

郑杰夫(1993-)，男，本科生；研究方向：水产养殖学.E-mail：243453426@qq.com.通讯作者：钟蕾(1976-)，女，副教授；研究方向：水产动物疾病.E-mail：zhonglei-5@163.com.