一例藏香猪混合感染猪流行性腹泻病毒与圆环病毒2型的报告

索朗扎西，许思遥，杨凡，李雨濛，樊毅，文军，朱玲，徐志文，4

（1.四川农业大学动物生物技术中心，四川成都611130；2.西藏自治区山南市琼结县农牧综合服务中心，西藏山南856800；3.阿坝州博文农牧科技有限公司，四川阿坝藏族羌族自治州624000；4.四川农业大学动物疫病与人类健康重点实验室，四川成都611130）

一例藏香猪混合感染猪流行性腹泻病毒与圆环病毒2型的报告

索朗扎西1，2，许思遥1，杨凡1，李雨濛1，樊毅1，文军3，朱玲1，徐志文1，4

（1.四川农业大学动物生物技术中心，四川成都611130；2.西藏自治区山南市琼结县农牧综合服务中心，西藏山南856800；3.阿坝州博文农牧科技有限公司，四川阿坝藏族羌族自治州624000；4.四川农业大学动物疫病与人类健康重点实验室，四川成都611130）

2016年3月四川九寨沟某藏香猪养殖基地出现10余例仔猪死亡案例，临床症状主要表现为呕吐，腹泻，水样稀便及消瘦，病程短，病死率高，呈典型病毒病症状。剖解发现小肠大面积充气，肠壁明显变薄，肠系膜淋巴结充血肿大，肾脏有大量出血点，腹股沟淋巴结充血肿大。采集病料进行实验室RT-PCR、PCR检测，结果为猪流行性腹泻病毒和圆环病毒2型阳性。结合临床症状、病理解剖特征及实验室检测结果，确诊为猪流行性腹泻病毒与圆环病毒2型混合感染。

藏香猪；猪流行性腹泻病毒；圆环病毒2型；混合感染

藏香猪，别名“藏血豚”、“人参猪”，是我国川西高原、云南、西藏、甘肃甘南和岷县特有的一种古老畜种，也是我国唯一的高原、高寒放牧猪种[1]。藏香猪除具有耐严寒、耐粗饲、抗病性强等优点外，猪肉特有的营养及风味使之成为高端产品的必选。伴随藏香猪养殖规模化程度提高，由此所致疫病增多、疫情更复杂，使藏香猪养殖面临着新的挑战和困难。2016年3月，四川九寨沟某藏香猪养殖基地出现10余例仔猪腹泻，主要表现为呕吐，腹泻，水样稀便及消瘦，病程短，病死率高，经采样后送四川农业大学动物生物技术中心做实验室检测。

1 材料与方法

1.1 临床症状及样品采集

2016年3月四川九寨沟某自繁自养式藏香猪养殖基地3～20日龄仔猪发病，主要表现为呕吐、消瘦、水样腹泻、腹泻1 d后迅速死亡。青霉素、链霉素治疗效果不明显，死亡率高。解剖后发现病理变化主要在肠道，出现明显的小肠肠壁变薄、充气、出血，肠内有未消化乳块，肠系膜淋巴结肿大、出血呈深褐色。采集症状典型新死亡仔猪肠黏膜、肠内容物、肠系膜淋巴结冰冻保存，送四川农业大学动物生物技术中心进行实验室病原学检测。

1.2 主要仪器和材料

Mastercycler PCR扩增仪（Eppendorf，德国）、Gel Doc 2000凝胶图像分析系统（BIO-RAD，美国）、2×Taq Plus PCR MasterMix（含染料）购自天根生化科技（北京）有限公司，反转录试剂盒、TakaRa Taq DNA酶和DL 2 000 DNA Marker（宝生物工程大连有限公司）。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank中收录的猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪轮状病毒（PoRV）、伪狂犬病病毒（PRV）、圆环病毒2型（PCV2）序列，设计特性检测引物（表1）。

表1 检测引物序列

1.4 病料处理及DNA/RNA提取

取采集病料0.5~2.0 g研磨，并按1∶3比例加入生理盐水配成病料悬液，随后反复冻融3次。冻融后按12 000 r/min离心5 min后取上清液，分别按照Trizol法和酚-氯仿法提取RNA和DNA，并将提取的RNA按照反转录试剂盒方法制成cDNA保存备用。

1.5 PCR扩增反应

将cDNA进行PEDV、TGEV、PoRV检测，提取的DNA进行PRV、PCV2检测。PCR扩增体系见表2，各病毒PCR扩增程序见表3。

表2 PCR扩增体系（20 μL）

表3 PCR扩增程序

2 结果

以实验室保存的阳性毒株作为各检测的阳性对照，若出现与阳性对照相符的目的条带，则判定为阳性，反之判定为阴性。琼脂糖凝胶电泳结果显示PEDV、PCV2为阳性，结果见图1。

图1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳

3 分析与讨论

藏香猪作为我国优良地方猪种，抗病性强、耐粗饲是其突出的优点。随着饲养模式的改变近年关于藏香猪病例报道也日益增加，2011年湖南报道了藏香猪传染性胸膜肺炎与毛首线虫混合感染案例[2]，2014年3月辽宁报道一起藏香猪感染附红细胞体致育成猪死亡42头、仔猪死亡138头的严重案例[3]，同年4月，贵州报道另一起藏香猪混合感染PRV、PCV2和附红细胞体的案例[4]，可见疫病控制是藏香猪规模化养殖过程中面临的新问题，其抗病性强的优点并不能起绝对的保护作用。经对本次病例送检样品进行相应分子检测，结果显示为PCV2与PEDV混合感染，分析认为，九寨沟县3月处于较为寒冷的初春季节，加之发病猪群没有接种PCV2、PEDV相关疫苗，这些因素均有利疫情的发生。PEDV和PCV2都会引起新生仔猪腹泻，早期Hirai等[5]就已经报道了新生仔猪的PEDV和PCV2双重感染病例，并有人提出PCV2可能参与新生仔猪PEDV感染的病理进程。临床观察发现感染PCV2的仔猪在感染PEDV时会出现更为严重的腹泻[6]。且已有试验证明，母猪感染PCV2后，会加快仔猪感染PEDV后的病程发展[7]。有研究指出，多病原混合感染会影响细胞因子的产生和表达类型，阻碍仔猪对PCV2的清除，仔猪体内细胞因子数量的下降为PCV2提供了有利的体内环境，从而促进病毒增殖[8]，可见二者在感染仔猪过程中存在关联。近期对四川PCV2流行病学调查结果也证实了以上观点，发生腹泻仔猪中PCV2阳性率呈现升高趋势，对四川13个地市436份样品检测，结果显示，PCV2阳性样本有312份，阳性率为71.55%，其中攀枝花市阳性率最高，达88.89%。而重点对采自9个地市的75份仔猪腹泻病料分析，共有66份PEDV阳性病料，总阳性率为88.00%，个别市区阳性率甚至达100%；75份样品PCV2的检出率高达80%[9]，可见目前四川PEDV、PCV2流行较为普遍，且混合感染严重。

建议发病场进行相关疫苗的免疫，母猪产前40 d、20 d用灭活疫苗配合活疫苗进行PEDV的加强免疫；按程序进行PCV2疫苗的免疫；同时加强综合措施，重点注意圈舍保温、保持干燥，病猪的隔离、对症处理及环境消毒，疫情很快得到有效控制。

[1]周治宏，贡吉卓玛.养殖技术顾问[J]，2012（12）：198-199.

[2]唐伟.现代畜牧兽医[J]，2012（7）：43-44.

[3]梅强.畜牧兽医科技信息[J]，2016（1）：64.

[4]姜玲玲，史开志，徐景峨，等.中国畜牧兽医[J]，2014，41（10）：225-229.

[5]Hirai T,Nunoya T,Ihara T,et al.Veterinary Record[J],2001, 148(15):482-484.

[6]Kim O,Chae C.Veterinary Pathology[J],2000,37(1):62-67.

[7]Jung K,Kim J,Ha Y,et al.Veterinary Journal[J],2006,171(3): 445-450.

[8]Chae C.The Veterinary Journal[J],2005,169(3):326-336.

[9]阳酉萍，黄小波，曹三杰，等.中国兽医学报[J]，2015，35（5）：704-710.

（编辑：郭玉翠）

S858.28

A

1002-1957(2016)05-0103-02

2016-07-12

四川省科技支撑计划（2014NZ0043；2015NZ0072）

索朗扎西（1981-），男，藏族，西藏拉萨人，兽医师，主要从事兽医方向研究.E-mail：15378277188@163.com