家畜止痢散抑菌和镇痛活性研究

保丹东，胡冰野

（1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省生化工程中心，贵州 贵阳 550025）

家畜止痢散抑菌和镇痛活性研究

保丹东1，胡冰野2

（1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省生化工程中心，贵州 贵阳 550025）

为了研究止痢散抑菌和镇痛的药理学作用，采用二倍稀释法、热板刺激、冰醋酸刺激小鼠扭体等方法研究止痢散的抑菌及镇痛作用。抑菌结果显示，止痢散最小抑菌浓度（MIC）为0.312 5 mg/mL，止痢散对于金黄色葡萄球菌的MBC为0.625 0 mg/mL，对于大肠杆菌的MBC为0.937 5 mg/mL。热板刺激结果显示，与给药前相比：止痢散低、中、高剂量组在给药后30 min痛阈值极显著减少（P＜0.01），在给药后1 h止痢散低、高剂量组痛阈值显著减少（P＜0.05）。冰醋酸刺激小鼠扭体结果显示，与空白对照组相比：阳性组小鼠扭体次数极显著减少（P＜0.01），止痢散低剂量小鼠扭体次数极显著减少（P＜0.01）；与阳性组相比：各试验组小鼠扭体次数极显著增加（P＜0.01）。结论：止痢散具有抑菌、镇痛作用；抑菌作用明显，镇痛作用不明显。

止痢散；抑菌；镇痛；痛阈值

多叶勾儿茶，为鼠李科勾儿茶属下的一个变种。产陕西、甘肃、四川、贵州、云南、广西，常生于山地灌丛或林中，海拔300～1 900 m有祛风利湿，活血祛痛，止咳化痰等功效，具有一定抗菌、抗炎作用。地榆，蔷薇科地榆属多年生草本植物，纺锤形粗壮跟，短柄小叶，紫红色花瓣，果实包藏萼筒内。地偷抗菌作用体外试验表明地榆对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等生长具有抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌抑制作用较强［1］。此外地榆还具有镇痛作用，典籍记载如下《本经》：“主妇人乳痓痛，七伤，带下病，止痛，除恶肉，止汗，疗金疮。”《昆明民间常用草药》：“治胃痛，胃肠出血。”乌药，双子叶植物纲，毛茛目山胡椒属，主要含有挥发油，异吡喹酮类生物碱，用于温中散寒，顺气止痛。乌药对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均有抑制作用。乌药叶也有镇痛作用：局部涂用可使血管扩张、血液循环加快、缓解复合肌肉痉挛性疼痛作用。最近报道［2］乌药、醋制乌药的水提液和醇提液具有镇痛作用。动物新兽药止痢散主要组成是多叶勾儿茶辅以地榆、乌药等中草药组合的新复方中药制剂。本实验以此组方作为实验抑菌、镇痛对象，通过对动物止痢散进行抑菌、镇痛等药效学实验研究，为临床运用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF级昆明小白鼠，体重20±2 g，购自解放军第三军医大学实验动物中心（动物许可证号：SCXK（渝）2012-0003），在贵州大学贵州省生化工程中心SPF级动物实验室（动物使用许可证号：SYXK（黔）2013-0001）饲养，试验过程中对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见（2006）》的规定。

1.1.2 实验试剂 止痢散原药、多叶勾儿茶、地榆、乌药（均由贵州省农业科学院畜牧兽医研究所提供）；冰醋酸（安徽深蓝医疗科技股份有限公司）；阿司匹林（上海颖心实验设备有限公司，批号：100113）；生理盐水（北京科友佳生物技术有限公司）、营养琼脂（上海博微生物科技有限公司，批号：140316）；10%胰酪胨大豆肉汤（广东环凯微生物科技有限公司，批号：3101010）。

1.1.3 药物保存 止痢散高剂量组按止痢散原药100 g+ 100 mL双蒸水稀释，止痢散中剂量组：按止痢散原药100 g+200 mL双蒸水稀释，止痢散低剂量组按止痢散原药100 g+900 mL双蒸水稀释；止痢散、多叶勾儿茶、地榆、乌药等药物均置于4摄氏度冰箱保存，使用时水浴加热到25摄氏度。

1.1.4 实验仪器 热板测痛仪、RE-52旋转蒸发器（上海生化仪器厂）；SBH-IIIA循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；电子天平（北京赛多利斯天平仪器厂）；KQ3200电热恒温水浴锅（北京医疗设备厂）；LS-B75立式压力蒸汽灭菌器（江阴滨江医疗设备厂）；DHG-9230A电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；HH-B11-360电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）；SW-CJ-1D型单人净化工作台（苏州净化设备有限公司）等。

1.2 实验方法

1.2.1 止痢散的抑菌作用 止痢散的准备：将止痢散（1.25 g/mL）原药采用高压灭菌。

大肠杆菌和金黄色葡萄球菌标准菌液准备，菌液准备主要包括复壮与计数，操作过程全部在超净工作台内进行。

（1）将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌种接种于10% NaCl胰酪胨大豆肉汤培养基中，37 ℃下在恒温培养箱静置培养24 h。

（2）移液枪吸取1 mL菌液用灭菌生理盐水进行十倍梯度稀释，稀释8个梯度，每个梯度吸取100 μL于营养琼脂平板上，用L棒轻轻摊匀，培养24 h，进行菌落计数。

（3）通过计算，选出每毫升菌液的活细菌数量级为108/mL的菌液保存待用。本实验所选出每毫升菌液的活细菌数为3.08×108/mL（原菌液稀释五倍）。

最小抑菌浓度（MIC）的测定：采用试管二倍稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）（此试验需在无菌操作台上进行，具体操作如下：

① 取无菌10 mL小试管18支平均分成2组，每管中加入10% NaCl胰酪胨大豆肉汤培养基1 mL，在第1支试管中加止痢散1 ml，用微量移液器混匀，吸取混匀液1 mL至第2管混匀，依次到第7管，再从第7管吸出1 ml混合液弃之，第8管（加大肠菌菌液不加中药）做阳性对照，第9管做阴性对照（加中药不加菌液），第10到第18支试管除第16支所加菌液为金黄色葡萄球菌外，其他处理同第1到8支。此时1到7号管、9到15号管内药液的浓度分别相当于0.625 0 mg/mL、0.312 5 mg/mL、0.156 3 mg/mL、0.078 1 mg/mL、0.039 1 mg/Ml、0.019 5 mg/mL、0.009 8 mg/mL生药浓度。

② 分别向各组的1至8号试管中加入0.1 mL大肠杆菌菌液、10至17号试管中加入0.1 mL大肠杆菌菌液，第9、第18支试管中加入0.1 mL普通肉汤培养基。

③ 将各组1至18号试管置于37 ℃条件下培养18 h，观察并记录结果。若有絮状杆菌沉淀，则有细菌生长，若无絮状沉淀，则细菌生长受到抑制。与对照组比较，以肉眼观察无絮状沉淀的试管药物浓度为最小抑菌浓度（MIC）。

1.3 最低杀菌浓度（MBC）的测定

测出最低抑菌浓度（MIC）后，观察药物MIC以上未见细菌生长的各试验培养物，分别吸取0.1 mL，移种至不含药的平皿培养基上置于37 ℃恒温箱培养24 h，观察有无细菌生长，按一般规定，平皿培养基中，细菌计数少于5个菌落者作为该药物的最小杀菌浓度（MBC）［3］。

1.4 止痢散的镇痛活性研究

1.4.1 冰醋酸致小鼠扭体法镇痛试验 将100只小鼠按随机次数分布表，随机分为5组，每组20只（雌雄各半），设生理盐水空白组、止痢散高、中、低剂量组，阿司匹林阳性对照组。除空白对照组给予同体积的生理盐水外，灌胃给药，在正常饲养基础上连续用药5 d，连续用药5 d，给药体积0.02 mL/g。末次给药后1 h，各组小鼠再腹腔注射0.7%冰醋酸溶液0.2 mL/只，观察15 min内出现扭体反应的次数［4］。

1.4.2 热板镇痛试验 实验分组、给药同扭体实验，各组小鼠热板实验测定受试化合物的镇痛作用：（20 ± 1）℃室温条件下，置小鼠于（55±0.5）℃热板，以接触热板至舔后足所经历的时间为痛阈值；剔除痛阈值≤3 s和≥30 s小鼠［5］；各小鼠给药前间隔5 min测量痛阈值2次，取平均值作为给药前（基础）痛阈值。灌胃给药，连续用药5 d。末次给药后1 h，分别测定每只30、60 min小鼠的痛阈值。

1.5 统计方法

2 结果

2.1 止痢散抑菌实验

2.1.1 最小抑菌浓度（MIC）结果的判断标准：由于中草药对细菌的MIC国内目前尚无统一的标准，本实验参照同类实验［6］的标准作为判断标准。即当MIC＜0.009 8 mg/mL生药浓度时絮状杆菌沉淀明显清晰可见；当MIC在0.019 5 mg/mL～0.156 3 mg/mL生药浓度时絮状杆菌沉淀清晰可见；当MIC为0.156 3 mg/mL～0.312 5 mg/mL生药浓度时絮状杆菌沉淀模糊不清；当MIC为0.312 5 mg/mL ～ 0.625 0 mg/mL生药浓度时为无絮状杆菌沉淀。

在本试验中，止痢散对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌表现为较敏感，其MIC为0.312 5 mg/mL。

2.1.2 最低杀菌浓度（MBC）结果如表1.2所示，止痢散对于金黄色葡萄球菌的MBC为0.625 0 mg/mL，对于大肠杆菌的MBC为0.937 5 mg/mL。

表2.1 不同菌种止痢散最低杀菌浓度（MBC）对照表

2.2 止痢散镇痛作用

2.2.1 止痢散对小鼠扭体试验的影响 结果如表2.2所示，与空白对照组相比：阳性组小鼠扭体次数极显著减少（P＜0.01）；止痢散低剂量小鼠扭体次数极显著减少（P＜0.01）。与阳性组相比：各试验组小鼠扭体次数极显著增加（P＜0.01）。

2.2.2 止痢散对小鼠热板致痛作用的影响 结果如表2.3所示，阳性组小鼠与给药前相比，在给药后30 min和1 h痛阈值都极显著减少（P＜0.01）；阳性组与空白组相比：给药后30 min痛阈值极显著减少（P＜0.01），药后1 h痛阈值显著减少（P＜0.05）。与给药前相比：给药后30 min和1 h止痢散低、中剂量痛阈值都极显著减少（P＜0.01）。与给药前相比：给药后30 min和1 h止痢散高剂量痛阈值分别极显著减少（P＜0.01）、显著减少（P＜0.05）。同一时间段与空白组相比：阳性组在给药后30 min痛阈值极显著减少（P＜0.01），给药1 h后痛阈值显著减少（P＜0.05）。同一时间段与阳性组比：止痢散低、中、高剂量组在给药后30 min痛阈值都极显著减少（P＜0.01），在给药后1 h止痢散低、高剂量组痛阈值显著减少（P＜0.05）。

S853.7

A

1006-799X（2016）10-0078-02

保丹东（1989-），男，贵州普安人，本科在读，主要研究方向动物医学。

贵州省重大专项（黔科合重大专项字［2013］6014）。