纳豆芽孢杆菌生产维生素K2的连续发酵工艺优化

牟 杰,印泽远,王 丽,周凌芸,张绮悦,李妙然,闫冬雷,姜 珊

(1.徐州医学院药学院,江苏徐州 221004;2.江苏省新药研究与临床药学重点实验室,江苏徐州 221004)



纳豆芽孢杆菌生产维生素K2的连续发酵工艺优化

牟 杰1,2,印泽远1,+,王 丽1,周凌芸1,张绮悦1,李妙然1,闫冬雷1,姜 珊1

(1.徐州医学院药学院,江苏徐州 221004;2.江苏省新药研究与临床药学重点实验室,江苏徐州 221004)

为优化维生素K2的高密度连续发酵生产工艺,通过对纳豆芽孢杆菌发酵培养,研究了培养基组成、转速、pH、溶氧量、后处理技术等因素对维生素K2产量的影响。实验结果表明以香菇菌渣复配蛋白胨为氮源(5%),甘油为碳源(5%),pH为7,通气比大于1.5 vvm,转速为600 r/min时,采用高密度连续发酵技术,5 L罐发酵产量最高达35.58 mg/L。发酵液萃取后,废液再通过纳滤膜截流,提高维生素K2回收率,并制成富含维生素K2的菌菇粉。维生素K2的结构经高效液相及质谱确证。大鼠急性毒性实验证明该菌菇粉产品安全无毒。

维生素K2,连续发酵工艺,纳豆芽孢杆菌

维生素 K2(Vitamin K2,VK2)是甲萘醌类脂溶性维生素,可以通过调节体内钙离子沉积,促进骨组织内骨钙素(BGP)的合成,预防和治疗骨质疏松症[1-3]。VK2的异构体根据其分子结构上C-3位异戊二烯单位的个数,以MK-n表示,其中MK-7生物活性最高。目前研究和开发的VK2制备方法主要包括化学合成法[4]和微生物发酵法,但天然VK2(MK-7)仅能通过微生物发酵法获得[5]。纳豆芽孢杆菌因其生长速度快、易于培养、VK2含量高等优势[6],成为发酵生产VK2最主要的微生物,是目前进行工业化生产VK2的理想物种之一。虽然众多研究人员开展了微生物发酵生产VK2的研究[7-10],但发酵技术仍不成熟。针对发酵过程中生物量低、生产速率低等问题,本研究对纳豆芽孢杆菌连续发酵生产VK2的培养基组成及发酵条件进行优化,简化操作单元,达到提高最终菌体生物量和目标产物的产率的目的,以期为VK2的大规模工业化生产提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

维生素K2标准品 昆明骨康保健品有限公司;香菇菌渣 徐州农业科学研究所;其余试剂 市售,分析纯;纳豆芽孢杆菌R127(CCTCC M2014405)(Bacillussubtilisnatto) 由南京工业大学黄和课题组提供;实验动物 SD大鼠,SPF级,雌雄各半,雌者无孕,体质量(200±20) g,由徐州医学院实验动物中心提供;固体培养基 30 g葡萄糖,40 g蛋白胨,5 g NaCl,5 g牛肉膏,5 g酵母膏,20 g 琼脂,1000 mL水。115 ℃灭菌30 min;液体培养基 50 g/L甘油,50 g/L大豆蛋白胨,0.6 g/L酵母粉,0.3 g/L K2HPO4,0.1 g/L CaCl2·H2O,0.3 g/L MgSO4·7H2O,溶剂为水。121 ℃灭菌30 min;香菇菌渣培养基 50 g/L甘油,50 g/L 香菇菌渣,0.6 g/L酵母粉,0.3 g/L K2HPO4,0.1 g/L CaCl2·H2O,0.3 g/L MgSO4·7H2O,1000 mL水。120 ℃灭菌30 min;香菇菌渣与蛋白胨复配培养基 50 g/L 甘油,15 g/L大豆蛋白胨,50 g/L香菇菌渣,0.6 g/L酵母粉,0.3 g/L K2HPO4,0.1 g/L CaCl2·2H2O,0.3 g/L MgSO4·7H2O,1000 mL水。120 ℃灭菌30 min。

高压蒸汽灭菌锅 北京盛达生物电子设备有限公司;Sorvall 离心机 美国科峻仪器公司;MAPADA UV-3100型紫外可见分光光度仪 上海美谱达仪器有限公司;5 L发酵罐Biostat B德国贝朗生物系统公司;LPG-25 喷雾干燥机 常州市利君干燥工程有限公司;UltiMate 3000 型高效液相色谱仪 美国Agilent公司;Finnigen-LCQ Advantage MAX液质联用仪 美国Finnigan公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种的培养与处理 菌种的活化:将保存在甘油管的纳豆芽孢杆菌接入固体培养基中进行接种活化(pH7.0～7.2,37 ℃,24 h)后进一步转移到液体培养基中进行摇瓶培养(pH7.0～7.2,37 ℃,120 r/min),液体培养至第二代即可进行发酵生产。

发酵生产:将二级种子接入装有液体培养基的发酵罐中,接种量10%(v/v),加入消泡剂,维持pH在7.0左右,通气量1.5 vvm,搅拌转速200 r/min,罐温37 ℃,培养60 h,发酵生产VK2。

1.2.2 生物量检测方法 生物量通过紫外分光光度计测定,每隔24 h测定一次OD600值,以未发酵的培养基作为对照,OD值达60以上为高密度。

1.2.3 高密度发酵工艺优化 将活化的纳豆芽孢杆菌接入装有100 mL香菇菌渣与蛋白胨复配培养基的500 mL摇瓶中,150 r/min,37 ℃进行发酵。当OD600值大于2时可以作为5 L发酵罐的菌种。按照10%接种量将活化后的芽孢杆菌接入装有复配培养基的5 L发酵罐中,按低转速200 r/min和高转速600 r/min两个条件分别发酵,通气量均为1.5 vvm,温度37 ℃,待甘油浓度降低至5 g/L左右时,结束发酵,称量生物量,检测VK2(MK-7)含量。

1.2.4 VK2(MK-7)的定性与定量检测 将10 mL纳豆芽孢杆菌发酵液移入250 mL带挡板的锥形瓶中,向发酵液中加入异丙醇和正己烷的混合液(1∶2∶4,v∶v),在摇床上220 r/min震荡30 min,静置分层后,取上清旋蒸,记录产物的质量,将所得的产物用异丙醇洗出,定容到10 mL的棕色容量瓶中。用液相色谱或质谱进行定性和定量分析。

VK2的定性通过被检测样品与标准VK2样品在液相色谱上洗脱位置的比较以及样品在质谱图上的离子碎片的特征表现来确定。

VK2的定量通过VK2标准品的浓度与液相色谱中对应峰面积的标准曲线计算而得。

液相色谱工作条件为:色谱柱:Brava-BDS C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)柱;流动相:100%甲醇;流速:1.0 mL/min;进样量:30 μL;柱温:50 ℃;检测波长:270 nm。

质谱测定时液相色谱的工作条件同上,质谱采用ESI全扫描检测。

1.2.5 富含VK2的菌菇粉制备 将发酵液通过微滤膜浓缩设备,回收菌体浓缩液,并收集滤出清液;将滤出的清液通过纳滤膜浓缩设备,截留分子量300 u以上的物质,回收截留浓缩液,滤出清液经处理后排放。合并菌体浓缩液和截留浓缩液,采用喷雾干燥机制粉。

1.2.6 大鼠急性毒性实验 取20只SPF级SD大鼠,随机分成给药组和空白对照组,每组10只,禁食不禁水12 h。给药组按大鼠最大灌胃给药体积100 mg/kg给予供试品(即富含VK2的菌菇粉),每天2次,空白对照组给予等体积的生理盐水。常规饲养14 d,记录动物体质量变化、外观、饮食、行为、排泄物及中毒反应等情况。第14 d时称重处死,解剖小鼠,肉眼观察其心、肝、肺、肾的外观。

2 结果与分析

2.1 VK2(MK-7)的定性和定量分析

取纳豆芽孢杆菌发酵液适量,按1.2.4方法提取其中的VK2(MK-7),并对提取液用液质联用(LC-MS)分析。液相色谱图见图1,图中保留时间为40.777 min的吸收峰与VK2(MK-7)标准品(图2)的保留时间一致。对液相色谱中的VK2特征峰进行质谱分析,结果如图3所示。从图3可以看出特征峰的分子量为649.3(M+1),与MK-7的分子量一致,说明液相色谱中40.777 min处的特征峰为本研究的目标产物VK2(MK-7)。

图1 发酵样品的液相色谱图Fig.1 HPLC of VK2(MK-7)in the fermentation sample

图2 100 mg/L VK2(MK-7)标准品的液相色谱图Fig.2 HPLC of VK2(MK-7)standard sample

图3 发酵样品VK2(MK-7)质谱图Fig.3 Mass spectrum of VK2(MK-7)

按照VK2的色谱检测条件,配制不同浓度梯度的VK2(MK-7)标准溶液,以进样浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。从图4中可以看出,MK-7标准曲线具有良好的线性关系,其线性回归方程为Y=0.7101X-0.3223,R2=0.9986,检出限为1 μg。在此色谱条件下,可以检测不同发酵周期的发酵液中VK2的质量浓度。

图4 VK2(MK-7)标准曲线Fig.4 Standard calibration curve of VK2(MK-7)

2.2 氮源的优化

本实验以甘油为碳源,对氮源进行了优化。从文献中可以知道,大豆蛋白胨是合成MK-7 的最佳氮源[11],但价格较高。为了降低生产成本,最好能选择更便宜的氮源。本实验按1.2.1的方法,通过检测VK2的产量来考察以香菇菌渣作为替代氮源的可行性,同时将香菇菌渣和蛋白胨复配,考察了部分替代的可行性(表1)。

从表1可以看出,大豆蛋白胨合成VK2含量最高,确实是最佳氮源。虽然香菇菌渣的含氮量与大豆蛋白胨相近,但发酵效果远不如蛋白胨;而以香菇菌渣与蛋白胨复配物为氮源时,VK2产量虽明显高于单独以香菇菌渣为氮源的情况,但仍低于蛋白胨。为提高VK2产量,本实验以香菇菌渣为主要氮源,蛋白胨作补充氮源,通过优化高密度发酵工艺参数来提高VK2产量。

表1 不同氮源对VK2产量的影响

Table 1 The effects of different nitrogen source on the yield of vitamin K2

培养基种类大豆蛋白胨干重(g/L)菌菇粉干重(g/L)MK-7(mg/L)液体培养基520701705香菇菌渣培养基05325295香菇菌渣与蛋白胨复配培养基15365067649

2.3 高密度连续发酵工艺的优化

采用香菇菌渣与大豆蛋白胨复配发酵培养基,按1.2.3的方法,在5 L发酵罐上开展纳豆芽孢杆菌高密度连续发酵产VK2的工艺优化研究。在5 L发酵罐中,当OD600保持在80左右,说明发酵罐中的菌种生物量较大,可视为高密度发酵。当培养基中甘油浓度降低至5 g/L左右时,结束发酵。然后按1.2.4的方法,用液相色谱检测VK2(MK-7)的产量。

本实验首先考察了转速(低转速200 r/min和高转速600 r/min)对发酵生产VK2的影响,不同转速下对甘油消耗的影响结果见图5,发酵时间对VK2产率的影响见图6。

从图5可以看出:转速对VK2产量影响很大。低转速(200 r/min)下,甘油消耗速度慢,发酵被抑制;高转速(600 r/min)下,甘油消耗速度较快,发酵60 h后,甘油被消耗完全,继续延长发酵时间,甘油消耗量变化不大。

图5 5 L发酵罐不同转速对甘油消耗的影响Fig.5 Effects of different rotate rate on the consumption of glycerol in 5 L fermentation tank

从图6可以看出:VK2的产量随发酵时间延长而增加,发酵60 h后达峰值,随着发酵时间延长而VK2产率反而降低;高转速(600 r/min)下发酵60 h后,VK2产量最高可达35.58 mg/L。

图6 5 L发酵罐中发酵时间对VK2产量的影响Fig.6 Effects of fermentation time on yield of VK2 in 5 L fermentation tank

然后考察了不同转速下溶氧(DO)对两种培养基发酵时间的影响(图7)。从图7可以看出:发酵20 h后,DO值大于20%,对复配氮源的高转速发酵更为有利。

图7 5 L发酵罐中溶氧对VK2产量的影响Fig.7 Effects of DO value on yield of VK2 in 5 L fermentation tank

图8为酸碱度对不同转速下两种培养基发酵时间的影响,从图中可以看出:高转速下复配氮源的发酵pH在发酵20～80 h之间较为稳定,保持在7左右,pH突然降低说明需要补料。

图8 5 L发酵罐中酸碱度对VK2产量的影响Fig.8 Effects of pH value on yield of VK2 in 5 L fermentation tank

结合培养基的优化及高密度连续发酵工艺的优化,得出最佳工艺条件为:以甘油为碳源,香菇渣与蛋白胨复配物为氮源,控制DO大于20%,通气量为1.5 vvm,600 r/min,温度37 ℃,pH7.0时,VK2发酵产量最高,可达35.58 mg/L。

2.4 富含VK2的菌菇粉制备方法

将发酵液经管式分离膜过滤,获得固形物含量20%以上的浓缩液,然后用卷式纳滤膜截留剩余发酵液中的VK2,可提高收率。将浓缩液和截留物与香菇菌渣、灰树花渣等菌菇渣经喷雾干燥器进行喷干制成干粉,可获得每克富含200 μg维生素K2的菌菇粉。

2.5 大鼠急性毒性实验

在连续14 d的观察中,大鼠外观、饮食、行为、排泄均未出现异常症状,也无死亡;处死后进行解剖,各器官未见异常。富含K2菌菇粉对雌、雄性大鼠经口LD50均大于2000 mg/kg体重,属无毒级。

组别给药前体质量(g)给药14d后体质量(g)体质量增长的百分率(%)空白对照组200±20260±182636富含VK2的菌菇粉组202±20264±162612

3 结论与讨论

在纳豆芽孢杆菌的发酵过程中,合适的氮、碳源以及氮碳比对维生素K2发酵具有重要作用。Yoshiki等发现以甘油为碳源、以蛋白胨为氮源的培养基中MK-7的产量和细胞增长速度都为最高[11]。由于蛋白胨的价格较高,造成生产成本过高,因此有必要寻找一种新的廉价的氮源。采用含氮量相近、成本低的香菇菌渣替代蛋白胨,可以“变废为宝”,提高资源利用率。本实验发现单独用香菇菌渣作氮源,生物量低,VK2收率低;但向香菇菌渣中加入过多的蛋白胨作复配氮源时,发酵体系中会产生大量泡沫,对底物消耗也会产生一定的抑制作用[12]。因此本实验采用50 g/L香菇菌渣和15 g/L的大豆蛋白胨的复配物作氮源。

纳豆芽孢杆菌是好氧菌,在小体系比大体系生产VK2能力更强,这可能是在大发酵体系中供氧不足,导致细胞代谢速率减缓,VK2生产力下降。通过在5 L发酵罐中对高密度发酵工艺参数的考察,我们发现高转速(600 r/min)、高溶液溶氧量(DO>20%)时,发酵60 h,VK2收率最高达35.58 mg/L。反应体系的pH控制在7左右,有利于高转速下复配氮源的发酵的平稳进行。同时,随着发酵时间的延长,发酵体系pH会突然降低,VK2产量随之下降,因此检测发酵体系的pH可以作为补料的依据。

发酵产生的VK2位于细胞膜上,在发酵过程中部分产品渗漏进入发酵液中,因此采用纳滤膜过滤发酵液,可以截留分子量100～1000的物质,提高VK2的收率。将VK2与香菇渣、灰树花渣等菌菇渣经喷雾干燥器进行喷干作成干粉,可以获得每克富含200 μg维生素K2的菌菇粉。该菌菇粉在急性毒性实验中,未见任何急性毒性反应,对大鼠LD50均大于2000 mg/kg体重,属无毒级。

本文报道的纳豆芽孢杆菌高密度连续发酵生产维生素K2的工艺在氮源、工艺参数、产物剂型上均进行了改进,为VK2的工业化大生产提供了理论依据。

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Optimization on the continuous fermentation process of Vitamin K2 fromBacillussubtilisnatto

MOU Jie1,2,YIN Ze-yuan1,+,WANG Li1,ZHOU Ling-yun1, ZHANG Qi-yue1,LI Miao-ran1,YAN Dong-lei1,JIANG Shan1

(1.School of Pharmacy,Xuzhou Medical College,Xuzhou 221004,China; 2.Jiangsu Key Laboratory of New drug and Clinical Pharmacy,Xuzhou Medical College,Xuzhou 221004,China)

TooptimizethehighdensitycontinuousfermentationprocessofVitaminK2,theeffectsofrawmaterialsconcentration,rotationrate,pH,dissolvedoxygen(DO)andpost-processingtechniqueswereinvestigatedbythefermentationofBacillus subtilis natto.ItwasfoundthattheoptimalconditionwasofGlycerol5%,soybeanprotein2%,mushroomcompost3%,pH7andDOof20%at600r/min.Thehighestyieldreached35.58mg/Lin5Lfermentationtank.Mushroomcompost,asasupplementarynitrogensource,canpromotethebiosynthesisofVK2,anditseffectiveconcentrationwas3%.Thefermentationbrothwasextractedbyextractliquorandfilteredbynanofiltrationmembrane.Asaresult,VitaminK2canbewellisolatedandtheVK2mixedmushroompowderwasobtainedthroughspraydrying.ThestructureofVitaminK2wascharacterizedbyHPLCandMS.Thequalityofproductwassafeandqualified.

VitaminK2;continuousfermentationprocess;Bacillus subtilis natto

2016-04-05 +为并列第一作者

牟杰(1974-),女,博士,副教授,研究方向:药物合成,E-mail:mou.jie@126.com。 印泽远(1998-),男,本科生,研究方向:抗肿瘤药物研发,E-mail:2504464354@qq.com。

国家级大学生创新创业训练计划项目(201510313028);江苏省大学生实践创新训练计划重点项目(201510313028Z);江苏省新药研究与临床药学重点实验室主任基金(ZR-XY201403);徐州医学院“振兴计划”。

TS201.3

A

1002-0306(2016)19-0157-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.022