INA抑制香蕉果实中活性氧积累和衰老进程提高果实的抗病性

张雪莲，黄雪梅，张 灿，张昭其，庞学群

（1.华南农业大学生命科学学院，广东 广州 510642；2.广东省果蔬保鲜重点实验室/华南农业大学园艺学院，广东 广州 510642）

INA抑制香蕉果实中活性氧积累和衰老进程提高果实的抗病性

张雪莲1，黄雪梅2，张 灿2，张昭其2，庞学群1

（1.华南农业大学生命科学学院，广东 广州 510642；2.广东省果蔬保鲜重点实验室/华南农业大学园艺学院，广东 广州 510642）

探讨了香蕉贮藏期间INA处理对广东果实抗病性的影响及影响机制。结果表明：香蕉果实在INA处理后接种炭疽病菌孢子，贮藏15 d 后，INA 处理的果实病斑直径比对照果实明显减小，INA处理的MDA含量显著低于对照，表明INA处理能够延缓果实的衰老；INA处理果实的H2O2含量从贮藏8 d开始明显低于对照，而NADPH 氧化酶活性则在贮藏10 d开始高于对照；在整个贮藏期间，INA处理的CAT活性均明显低于对照，抗坏血酸氧化酶活性则明显高于对照。在贮藏后期，INA促进APX 基因的表达，却抑制了CAT和后熟相关基因P450的表达上调。说明在贮藏期间INA 主要通过促进防御酶APX基因和酶活力抑制后期果实活性氧含量的增加，以诱导香蕉果实抗病性的增加。

INA处理；抗病性；活性氧；APX；P450

采后香蕉病害主要是由于炭疽病菌的潜伏侵染导致，通常在贮藏期导致果实严重腐烂，造成极大经济损失。目前在生产上主要通过化学杀菌剂来抑制采后香蕉病害，由于其潜伏侵染的特性，化学杀菌剂控制香蕉采后病害的效果不太理想，不得不加大使用量。但是过多使用化学杀菌剂易造成毒性残留和病原菌的抗药性，极大限制了化学杀菌剂在果蔬生产上的广泛使用［1］。因此，探讨安全有效的果蔬采后病害控制技术受到人们的广泛重视。近年来，诱抗剂在控制果蔬采后病害中的应用逐渐得到重视，尤其是潜伏侵染病害。利用生物源或者非生物源的因子诱导果蔬自身抗病能力的提高，为果蔬采后病害的防治以及贮藏品质的保持开辟了一条安全环保的途径［1-2］。

目前，化学诱抗剂如水杨酸（SA）、苯并噻二唑（BTH）、茉莉酸类（JAs）、赤霉素和乙烯等因具有广谱、有效的优点，已成为当前研究的重点和热点［3］。例如，晏卫红等［4］在芒果挂果期利用草酸和SA处理果实，结果显示草酸和SA能显著提高采后果实在贮藏期间对蒂腐病和炭疽病的抗性。此外，乙烯通过诱导植物组织内防御相关酶的活力来促进内源植保素等抗菌物质的大量合成，从而达到提高植物抗性的目的［5］。这些研究也发现，使用外源SA、MJ和BTH等生物因子诱导采后果蔬时，果蔬体内往往存在活性氧爆发的现象［6］。活性氧是生物体代谢的产物，对生物细胞有氧化损伤作用，造成生物体代谢的紊乱［7］。然而近年研究发现，活性氧对细胞增殖、生理机能和发育能力等生物学进程是必须的，推测活性氧可能作为一种植物胞内信号分子参与细胞信号传导和调控［8］。

人工合成的2，6 二氯异烟酸（INA）是一种类似SA的化合物，能激活植物系统获得性抗性反应（SAR），并提供广谱的抗病性。INA处理不但可以提高马铃薯叶片对致病疫霉菌的抗性［6］，还可以诱导番茄、茄子和辣椒等植株产生抗虫能力［3］，还可以有效抑制柑橘植株黄龙病的发生［9］。更多研究表明，INA处理不但能提高植株整体的抗病性，还可以提高采后香蕉和柑橘果实的抗病性［10-11］。我们前期研究发现，香蕉果实经INA渗透处理后3～12 h内，果实H2O2含量和NADPH氧化酶活性明显高于对照［10］。在上述研究基础上，本试验采用INA溶液对采后香蕉果实进行渗透处理，进一步探讨贮藏过程中INA处理对香蕉果实抗病性的诱导效果，及其与活性氧水平、活性氧产生和清除相关酶类以及抗病相关酶活性与基因表达变化的关系，以期为香蕉的贮藏保鲜提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试香蕉品种为巴西香蕉（Musa. AAA Group，Cv. Brazil），成熟度为7～8成，采自广州市南沙区果园，落梳后运回实验室，选择果实颜色、大小均匀、无病虫害及机械伤的果实，用0.1%漂白粉浸果实5 min，然后立即用干净自来水冲洗，晾干备用。

1.2 试验方法

1.2.1 诱导抗病处理 在低压（0.8 MPa）条件下，将香蕉果实置于0.5 mg/L INA 溶液中渗透处理5 min，接着在常压下继续浸泡5 min；INA处理6 h后接种炭疽病菌孢子，以清水作对照。分别在处理0、4、6、8、10、12、15 d取样，液氮速冻之后存于-80°冰箱备用。

1.2.2 接种处理 炭疽病菌种由华南农业大学资源环境学院植物保护系提供。按黄雪梅等［10］方法对INA处理和对照果实接种炭疽病菌，置于20℃贮藏15 d，定期评价病情指数。参照黄雪梅等［2］方法，按病斑扩展程度病斑大小判断病情，以病斑扩展垂直两个方向的平均宽度计算。

1.2.3 丙二醛（MDA）含量测定 参照Zhang等［12］方法测定贮藏期间香蕉果皮MDA含量。

1.2.4 过氧化氢（H2O2）含量测定 取香蕉果皮1 g，液氮充分研磨后加入3 mL双蒸水充分混匀，室温下溶液12 000 g离心15 min。取上清液1 mL，按过氧化氢试剂盒（南京建成生物工程研究所研发）的加样步骤进行测定。

1.2.5 过氧化氢酶（CAT）活性测定 参照范兰兰等［13］方法获得粗酶提取液。在2.9 mL 0.2% H2O2（50 mmol/L、pH 7.8磷酸缓冲液配制）溶液中加入100 μL粗酶液。充分混匀后，监测OD240，以每分钟减少0.001表示1个酶活力单位（U），酶活性以U/g表示，3次重复。

1.2.6 抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定 取1.0 g香蕉果皮，液氮研磨后参照赵会杰等［14］方法获得粗酶。在2.75 mL反应液中加入100 μL粗酶液，然后加入150 μL 0.1% H2O2启动反应，测定反应体系OD290在3 min内的变化，以每分钟 OD290减少0.001表示1个酶活力单位（U），酶活性以U/g表示，3次重复。

1.2.7 细胞膜微膜囊提取 根据Morre等［15］方法提取贮藏期间香蕉果皮的细胞膜微膜囊。

1.2.8 NADPH氧化酶活性测定 参考黄雪梅等［10］方法测定香蕉果皮NADPH氧化酶活性。根据XTT的比吸收系数（2.16×104L/mol cm-1）换算活性氧的量，酶活力单位为μmol/min·g。

1.2.9 香蕉果皮CAT、APX、P450基因克隆和表达分析 参照文献［16］的热硼酸法提取香蕉果皮的总RNA。根据NCBI发表的香蕉CAT（ABV55108.1）基因片段的序列设计特异引物克隆上述基因的片段。根据其他物种APX和P450基因的保守区域，设计兼并引物克隆香蕉中的APX和P450基因片段进行地高辛探针的标记、RNA转膜和Northern杂交分析［17］。各基因的地高辛标记引物分别为：CAT上游：5’- GTGCCCGGCATCTACTACTC-3’，下游：5’-TGGAATGGGGAATCTCTCTG-3’；APX上游：5’- ACACACACTGGGAAGGTGCC-3’，下游：5’-TATTGGTGAGATGTTTCCGA-3’；P450上游：5’- GGATGTATGTGAATGCTTGG-3’，下游：5’- TTAATTGCACAAATCGACAC-3’。

2 结果与分析

2.1 INA处理对香蕉果实贮藏期间炭疽病病斑直径的影响

贮藏期间，对照和INA处理的香蕉果实炭疽病病斑直径都呈上升趋势。对照果实在贮藏前8 d病情指数迅速增加，贮藏15 d炭疽病病斑直径达到25 mm。与对照相比，INA处理的香蕉果实病斑扩展缓慢，贮藏8 d病斑直径仅为4 mm，病斑直径大小与对照处理4 d的大小相当，INA处理贮藏15 d的病斑直径大小为13 mm，与对照贮藏10 d的病斑直径大小相当，表明INA能有效延缓香蕉炭疽病的病情发展（图1）。

图1 INA处理对香蕉果实贮藏期间炭疽病病斑直径的影响

2.2 INA处理对香蕉果实贮藏期间MDA含量的影响

MDA是膜脂过氧化程度的重要指标，其积累量与过氧化程度呈正相关。植物组织受到伤害和衰老都会诱发大量自由基产生和膜脂过氧化发生，从而产生大量MDA。从图2可以看出，对照和INA处理的香蕉果实在贮藏期间MDA含量都有上升趋势，但INA处理的果实MDA含量低于对照，对照果实在贮藏0、2、10 d MDA含量分别是2.5、2.7、3.3 μmol/mg，比INA处理果实的MDA含量要高2～2.5倍。推测香蕉病情发展和果实成熟衰老有较大关系，INA处理较好抑制了果实病情发展。

图2 INA处理对香蕉果实贮藏期间MDA含量的影响

2.3 INA处理对香蕉果实贮藏期间H2O2含量的影响

对照和INA处理的香蕉果实在贮藏前期（0～8 d）的H2O2含量相差不大、维持在700～800 mmol/L（图3）。随着贮藏时间的延长，贮藏8 d后，对照果实的H2O2含量迅速上升，贮藏15 d H2O2含量达到1 700 mmol/L，而INA处理的果实在贮藏10 d后H2O2含量才开始提高，且在贮藏后期H2O2含量始终低于对照。与对照相比，INA处理的香蕉果实中H2O2爆发的时间推迟了2 d，这可能与香蕉果实病情发展和后期成熟有关。结果表明，INA处理降低了贮藏后期H2O2积累量，推迟了后期H2O2含量爆发的时间。

图3 INA处理对香蕉果实贮藏期间H2O2含量的影响

2.4 INA处理对香蕉果实贮藏期间NADPH 氧化酶活性的影响

NADPH oxidase是一种植物体内的氧化还原酶，通过结合胞质中的NADPH催化细胞胞外的O2生成超氧阴离子（O2·-），最后生成。从图4可以看出，在贮藏期间，对照和INA处理的NADPH 氧化酶活性呈现先缓慢下降、后急剧上升的趋势。其中，贮藏0～2 d INA处理果实的NADPH 氧化酶活性分别为3.1和2.8 μmol/min·g，均高于对照。INA处理的NADPH 氧化酶活性在贮藏4 d降到最低，此后一直维持在较低水平；直到贮藏12 d，INA 处理果实的NADPH 氧化酶活性开始迅速上升到3.3 μmol/min·g。对照果实的NADPH 氧化酶活性在贮藏10 d降到最低，之后迅速升高，但是对照中的NADPH 氧化酶活性增加速度不及INA处理。INA和对照果实贮藏后期NADPH 氧化酶活性提高可能与果实后熟生理机制发生变化有关。

图4 INA处理对香蕉果实贮藏期间NADPH oxidase活性的影响

2.5 INA处理对香蕉果实贮藏期间CAT活性的影响

CAT是一种以铁卟啉为辅基的结合酶，通常被认为是参与生物防御体系的关键酶之一。这是因为CAT可催化生物体内的H2O2分解为分子氧和水，使细胞避免受到活性氧的毒害。在贮藏期间，INA处理香蕉果实中的CAT活性由500 U/g 逐渐下降到贮藏8 d的248 U/g。贮藏10 d INA处理的CAT活性有所恢复，在贮藏12 d达到较高值，之后又开始下降；对照在贮藏初期CAT活性处于较低水平，贮藏4 d升高，之后一直保持较高，到后期有所下降，其中贮藏8 d后突然下降。在整个贮藏过程中，INA处理的果实果皮中CAT活性明显低于对照（图5）。

2.6 INA处理对香蕉果实贮藏期间APX活性的影响

图5 INA处理对香蕉果实贮藏期间CAT活性的影响

从图6可以看出，在整个贮藏期间，对照果实的APX活性基本上维持在50 U/g左右，直到后期才有所下降。INA处理果皮APX活性则呈现上升趋势，到贮藏15 d高达170 U/g，而对照果实中的APX活性仅为27.875 U/g，两者APX活性差异达到显著水平。从贮藏4 d开始，INA处理的APX活性始终高于对照，因此我们推断，在贮藏期间INA诱导高活力的APX清除果皮中的活性氧。

图6 INA处理对香蕉果实贮藏期间APX活性的影响

2.7 INA处理对贮藏期间香蕉果皮基因表达的影响

我们进一步从基因角度探讨了抗病诱导相关基因在提高香蕉果实抗病性中的作用。在香蕉贮藏前4 d，处理和对照果实具有较高水平的CAT表达。INA处理的CAT表达量到贮藏6 d下降到最低水平，贮藏10 d出现高峰，此后维持在一个较高水平。从贮藏8 d开始，对照的CAT表达量开始明显下降，在贮藏后期（10～15 d），INA处理的CAT表达量始终显著高于对照。

与CAT基因表达相比，APX基因受INA诱导表达上调，特别是在贮藏前期（0～8 d），INA处理果实中APX的表达明显强于对照。但随着贮藏时间的推移，INA处理中APX基因表达量有所下降，与对照相近。

P 4 5 0酶系属于单加氧酶（monooxy genase），具有解毒作用，又称为多功能氧化酶、羟化酶，因其还原态的吸收峰在450 nm处得名。无论是对照还是INA处理，随着贮藏时间推移，P450基因表达量均逐渐增加。在贮藏8 d，对照和处理的P450基因开始有少量表达，此后P450基因在对照和处理组中表达量迅速上升。贮藏12 d，对照的P450基因出现表达高峰，而处理果实的P450基因表达高峰在贮藏15 d才出现。在贮藏后期，对照的P450基因表达量始终高于INA处理的基因表达。

3 结论与讨论

图7 INA处理对贮藏期间香蕉果皮CAT、APX、P450基因表达的影响

活性氧一直被认为在植物生长发育过程中起着重要作用，它们是植物有氧代谢过程中产生的毒害物质，同时还作为信号分子启动很多重要的生理反应。黄雪梅等［10］指出，INA渗透处理后6 h内，香蕉果皮出现H2O2含量高峰，暗示H2O2可能作为一种信号提高香蕉德抗病性。该结果有力支持了H2O2作为一个信号分子的学说［8］。本研究进一步发现，在贮藏期间，采后香蕉果实炭疽病的发生与其后熟进程关系密切。对照香蕉果皮变黄后，炭疽病斑迅速扩展，病情急剧加重，果皮中H2O2含量迅速升高；而INA渗透则能较好地控制炭疽病发展、延缓果实后熟进程以及推迟果皮中H2O2含量上升。众所周知，当植物处于逆境条件（胁迫）下，活性氧可引发生物膜中不饱和脂肪酸的过氧化作用，对生物膜造成损伤，从而引起机体一系列生理生化变化，最终造成代谢紊乱［8］。由此我们推测，贮藏后期香蕉果实与炭疽病菌互作，产生和积累大量的H2O2。

在胁迫环境中，植物体内活性氧含量上升往往伴随着SOD、POD、CAT、APX等保护酶活性增加，相关研究表明，这些抗氧化物酶同样也参与了果实的后熟调控［19］。本试验发现，从贮藏2 d开始，INA处理的APX活性一直保持在较高水平，到贮藏10 d活性又迅速增强，而对照一直处于较低水平（图4）；从基因表达上看，变化趋势大致相符（图7）。APX是清除叶绿体中H2O2的关键酶类［20］。结合INA处理果实中后期APX活性迅速增强的现象，我们推测，处理后期APX活性的增加有利于清除叶绿体中过多的H2O2，延缓叶绿素降解、果实后熟，从而达到抗病目的，具体作用机制还有待进一步研究。黄雪梅等［10］发现，INA渗透处理能在早期诱导香蕉CAT活性升高，而本研究发现，在贮藏期间，INA处理果实的CAT活性迅速降低，且在贮藏8 d达到最低水平。这可能是因为CAT与APX两者对H2O2的亲合力不同，属于两种不同的H2O2清除酶类［21］，在香蕉贮藏的不同时期起着不同作用。

P450是一类以还原态与CO结合后在波长450 nm处有吸收峰的含血红素的单链蛋白质，被认为在植物体中担当着生物合成和代谢解毒两大功能，其中有一些P450在植物防御反应中具有重要作用［22］，但P450基因在采后香蕉果实抗病性的研究还较少。从贮藏8 d开始，处理和对照果实中P450基因表达受到诱导，表达量逐渐增加，但处理的P450增加量显著低于对照（图7）。贮藏后期，香蕉果实进入后熟阶段，果皮颜色开始转黄，表明P450基因表达与果实成熟关系密切。由此推测，INA通过延缓贮藏期间P450基因的表达来抑制香蕉果实的后熟衰老进程，进而提高了果实对病原物的抗性。

本研究发现INA渗透处理能抑制接种病斑的扩大，减慢炭疽病的发展进程，表明INA对采后香蕉果实具有诱导抗病作用。由于INA是SA的结构和功能类似物，具有较好的食品安全性，因此，本研究结果为果蔬采后病害的生物防治提供了新思路。

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（责任编辑 白雪娜）

2，6-Dichloroisonicotianic acid repressed reactive oxygen species content and fruit ripening to induce disease tolerance in banana （Musa AAA. cv. Dongguang）

ZHANG Xue-lian1，HUANG Xue-mei2，ZHANG Can2，ZHANG Zhao-qi2，PANG Xue-quan1
（1.College of Life Science，South China Agricultural University，Guangazhou 510642，China；2.Guangdong Key Lab for Postharvest Science of Fruits and Vegetables/College of Horticulture，South China Agricultural University，Guangazhou 510642，China）

The possible mechanism of INA on disease-tolerance in postharvested banana （Musa AAA. cv. Dongguang） was investgated. Ther results showed that INA treatment effectively reduced the disease spot sizes on the peel of banana fruit when inoculated with spore suspension of Collectotrichum musae after INA treatment and cultured for 15 d. During storage，MDA content increased in both INA treatment and control；however，INA treatment markedly inhibited the MDA content，suggesting that INA retarded the fruit ripening. The content of H2O2in INA treatment was obviously lower than that in control from the 8th d，while high activety of NADPH oxidase in INA treatment was found from the 10th d. An induced CAT activity was found in control during storage；however，high APX activity was detected in INA treatment. During the later storage，INA induced the APX gene expression，but repressed the expression of CAT and P450. The results suggested that enhancing APX activity/gene expression could reduce H2O2level to improve banana disease tolerance during storage.

INA treatment；disease tolerance；reactive oxygen species （ROS）；APX；P450

S 668.1；S 379

A

1004-874X（2016）11-0109-07

2016-07-16

国家“十二五”科技支撑计划项目（2015BAD16B07）；国家自然科学基金（30771515）

张雪莲（1980-），女，博士，讲师，E-mail：xuelianzhang@scau.edu.cn

通迅作者：庞学群（1968-），女，博士，教授，Email：xqpang@scau.edu.cn

张雪莲，黄雪梅，张灿，等. INA抑制香蕉果实中活性氧积累和衰老进程提高果实的抗病性［J］.广东农业科学，2016，43（11）：109-115.