郭战胜,侯旭光
( 山东大学(威海)海洋学院,山东 威海 264209 )
鲍科染色体研究进展
郭战胜,侯旭光
( 山东大学(威海)海洋学院,山东 威海 264209 )
鲍;染色体核型;染色体带型;荧光原位杂交
鲍科动物简称鲍或鲍鱼,隶属于软体动物门、原始腹足目,是重要的海生单壳经济贝类。鲍现存56种,除北冰洋外,世界大部分海域都有分布,目前能够进行规模化捕捞和养殖的种类有20余种。
随着鲍养殖业的兴起和快速发展,对鲍的各项研究也逐渐开展,主要涉及遗传育种、养殖技术、生态、分子和细胞学方面的研究[1-8]。细胞遗传学是遗传育种研究的基础,其中染色体研究是细胞遗传学研究的重要内容之一,主要包括染色体核型分析、带型分析、功能基因定位等。这些研究不仅为鲍遗传育种提供理论依据,同时对认识和探索鲍染色体分类系统和进化关系具有重要意义[9-10]。截至目前,鲍科中有17种开展过核型研究,2种进行过带型研究。笔者通过对鲍科染色体的研究成果的总结,讨论今后发展的途径和方向。
核型是指染色体组在有丝分裂中期的表型,包括染色体数目、大小、形态特征的总和。目前有17种鲍染色体核型被研究和报道(表1)。染色体数目有2n=28、2n=32和2n=36 3种类型。其中具有28条染色体的有1种,32条染色体的有5种,36条染色体的有11种。根据核型公式,具有相同数目染色体的鲍核型差异不大,所有种类都有中部着丝粒染色体和亚中部着丝粒染色体两种主要类型,杂色鲍(Haliotisdisversicolor)、羊鲍(H.ovina)、黑鲍(H.cracherodii)和绿鲍(H.fulgens)还含有端部着丝粒染色体。
由表1可知,同一种鲍试验研究得到的核型公式结果显示不一致,可能有4方面原因:(1)试验过程中,如使用秋水仙素含量的大小、使用低渗液的种类和含量以及低渗处理时间的长短等均影响核型数目与形态的变化;(2)染色体着丝粒断裂、融合或结构重排等造成的同一物种不同个体染色体核型多态现象[13];(3)不同地理种群长期分化造成核型多态现象;(4)试验者操作、观察造成误差。
杂交是育种的重要手段,染色体核型分析可以用于鉴定杂种是否真正产生。Cai等[17]对杂色鲍雌鲍与盘鲍(H.discusdiscus)雄鲍杂交F1核型分析表明,杂交子代染色体数目是多变的,包括2n=32和34,同时还有很多非整倍体。柯才焕等[18]证实这两种鲍不是真正意义的杂交,而是盘鲍精子刺激杂色鲍卵子引起的雌核发育。Amar-Basulto等[27]对红鲍(H.rufescens)、皱纹盘鲍(H.discushannai)及其杂交子代进行核型分析,结果表明染色体数均为2n=36,核型分别为10m+7sm+1st、10m+8sm和10m+7sm+1sm/st,3种鲍染色体具有一定同源性,但是杂交鲍第16对染色体与其他两种不同,可以进行种类鉴别。Botwright等[44]对澳大利亚黑唇鲍(H.rubra)、绿唇鲍(H.laevigata)及其杂交鲍核型进行分析,结果表明3种鲍染色体数目2n=36,核型为10m+7sm+1st,黑唇鲍与绿唇鲍核型具有高度同源性,使杂交受精率比较高。在杂交育种过程中,杂交子代与双亲染色体的数目、形态、臂长和臂比的区别都可以用于验证双亲是否真正杂交。除此之外,分子标记、形态学标记等也可以鉴定杂交与否。
表1 鲍科染色体研究概况
注:2n,二倍体数目; m,中部着丝粒染色体;sm,亚中部着丝粒染色体;st,亚端部着丝粒染色体;t,端部着丝粒染色体; sm/st 代表染色体可归为两种类型;C,C带;NORs,银染带;G,G带.
鲍科现存56种,进行染色体研究的有17种,由表1可知,疣鲍2n=28,分布于地中海地区;杂色鲍、羊鲍、平鲍、多变鲍和耳鲍2n=32,分布于印度—太平洋地区;其余11种2n=36,分布于北太平洋地区和南非—澳大利亚地区。这一鲍科染色体数目分布是有规律的,支持目前学术界广泛接受的进化模型—特斯拉海起源模型:原始鲍种起源于古代特拉斯海,经过进化引发现代地中海鲍种和印度洋热带鲍种的产生。印度洋热带鲍种分别向东南方向和东北方向迁移; 其中,在东南方向迁移引发南非、澳大利亚、新西兰和热带西太平洋鲍种产生;在东北方向迁移引发北太平洋鲍种产生,北太平洋鲍种又辐射出加利福尼亚和北太平洋鲍种[43]。
染色体显带技术是指通过一定的染色步骤使染色体一定部位内呈现出深浅不一条纹的细胞学方法,实质是染色体经过酸、碱、盐或酶等生物或物理方法的处理,使染色体裂解或者DNA片段断裂或者丢失,由DNA或者蛋白质差别提取及染料在DNA侧面的堆积而导致产生条纹[44]。它不仅能够准确地将同源染色体进行配对和核型排列,而且能够精细地辨认染色体的结构和变化[13]。染色体显带技术在高等动物中已经得到了广泛应用,但是在海洋贝类中尤其是鲍科中研究报道相对较少。
C带是指染色体经过酸、碱、盐溶液的作用,常染色质DNA被抽提掉,而显示着丝粒及其他部位异染色质。C带具有物种和染色体特异性,可以鉴别染色体和研究染色体的结构功能。目前仅有皱纹盘鲍和红鲍开展过C带研究(表1),蔡明夷等[28]对皱纹盘鲍C带开展研究,结果表明皱纹盘鲍C带包括着丝粒、端部和臂间C带3种类型,着丝粒C带的分布比较稳定,而端部和臂间C带分布相对不稳定,呈现出多态性。
NORs带指染色体上具有活性或者潜在活性的核仁组织区酸性蛋白进行银染而显色的条带,没有活性的无法显示染色。NORs的位置和数目随着物种而改变,可以用来进行亲缘关系和物种进化的相关研究。目前仅皱纹盘鲍开展过NORs研究(表1)。Okumura等[24]研究皱纹盘鲍NOR带,结果发现NOR带显示在2 对染色体的长臂端部,然而不同细胞中NOR带在染色体显示的编号不同,这种NOR位置的不确定性可能与rRNA 基因的转录活性有关。Wang等[29]对皱纹盘鲍福建养殖群体细胞遗传学研究,结果表明NORs通常位于第14和17号染色体长臂末端,有时候在别的染色体短臂末端也有分布。NORs 带的数目一般随演化程度的提高由少变多,鲍NORs 数据对揭示其进化关系有一定帮助。
荧光带型是指根据荧光染料在染色体不同结构区域显示的颜色深浅不同而产生的带型,通常用于揭示染色体上的 AT/GC 富含区, 该带型可作为识别特定染色体的重要标志[45]。目前有6种鲍进行过荧光带型研究,包括皱纹盘鲍、红鲍及其杂交鲍、黑唇鲍、绿唇鲍及其杂交鲍(表1)。Amar-Basulto等[27]利用DAPI荧光确定皱纹盘鲍、红鲍及其杂交鲍荧光带型在染色体分布位置的不同,可以进行种类鉴别;Gallardo-Escarate等[37]利用DA/DAPI荧光染料确定红鲍染色体DNA浓度;Natasha[44]对黑唇鲍、绿唇鲍及其杂交鲍染色体荧光带型进行分析,鉴别种类。
荧光原位杂交技术是一种快速、准确、灵敏的细胞遗传学分析技术,被广泛应用于染色体重排与进化、早期性别鉴定、基因定位、染色体鉴别及杂交鉴定等方面。荧光原位杂交技术基本原理是根据DNA碱基互补配对原则,利用荧光标记的已知序列单链核苷酸作为探针,与待测样本中染色体上互补的单核苷酸序列特异性结合,经荧光检测体系在镜下对待测染色体DNA进行定性、定量或相对定位分析。该技术已经广泛应用于高等动物,但在海洋贝类尤其是鲍中的应用仍较少。
端粒是指染色体末端所特有的帽子片段。高等动物的端粒序列包括数百次(TTAGGG) 的核苷酸重复,但是绝大部分海洋贝类的端粒序列还是未知的。目前,报道有4种鲍利用FISH技术进行端粒序列定位,包括皱纹盘鲍、红鲍、绿鲍和黄鲍(表1)。Mizuho等[26]利用荧光原位杂交技术对皱纹盘鲍端粒序列进行研究,分别运用(TTAGGG)n和(TTAGG)n序列探针对皱纹盘鲍染色体进行荧光标记,结果表明,(TTAGGG)n探针在皱纹盘鲍所有染色体端粒区域都有信号,但是(TTAGG)n探针却没有明显的信号,说明皱纹盘鲍端粒末端含有(TTAGGG)n序列。Gallardo-Escárate等[40]利用(TTAGGG)n和 (GATA)n微卫星序列作为探针对绿鲍和黄鲍端粒序列进行分析,结果表明(TTAGGG)n序列在两种鲍所有染色体端部均有信号,但是(GATA)n序列仅在一些染色体间区和末端有信号。同时,Gallardo-Escárate等[35]对红鲍端粒序列进行分析,结果与绿鲍、黄鲍结果一致。上述结果说明重复序列(TTAGGG)n有可能是鲍的端粒序列。
通过利用荧光原位杂交技术对核糖体rDNA定位,可以明晰染色体NORs的分布情况,荧光原位杂交技术弥补了银染法检测NORs的不足,对有或无转录活性的NORs位点都可以检测到。目前,共有皱纹盘鲍、红鲍、绿鲍和黄鲍4种鲍进行过rDNA定位研究(表1)。蔡明夷等[28]对皱纹盘鲍rDNA定位,结果表明, 皱纹盘鲍中期染色体上分布着4个大亚基 rDNA 位点。Wang等[29]对皱纹盘鲍18 S rDNA位点定位进行分析,结果表明18 S rDNA位点具有多态性,但是通常在14和17号染色体长臂末端端粒区域具有较强的信号。Gallardo-Escárate等[35,40]对红鲍、绿鲍和黄鲍研究结果表明,3种鲍均有2个信号明确和若干个不稳定的大亚基 rDNA 位点。核糖体内rDNA基因进化速度很缓慢,rDNA的荧光原位杂交定位结果可被用于鲍的生物系统进化研究,验证鲍科动物进化模型——特斯拉海起源模型的正确性。
随着分子生物学技术的快速发展,细胞生物学与分子生物学相结合进行研究成为海洋生物研究的热点。其中以染色体研究结果为参考,进行的分子生物学研究主要有大片段基因组文库构建、遗传连锁图谱和物理图谱的绘制与整合、功能基因在染色体上的定位等等。在海洋生物,尤其是在鲍科动物中,与染色体研究相结合进行的分子生物学研究十分缓慢,仅限于遗传连锁图谱构建及QTL定位、着丝粒作图与遗传图谱整合。
遗传连锁图谱是指某一物种的染色体图谱,显示所知的基因和/或遗传标记的相对位置,而不是在每条染色体上特殊的物理位置,而QTL是指在染色体上具有表达效应的节段。遗传连锁图谱的构建及QTL定位为水产养殖生物的规模化育种提供重要的遗传理论基础[46]。目前,在鲍科中共4种鲍构建了遗传连锁图谱和QTL定位,包括非洲鲍[47]、黑唇鲍[48]、杂色鲍[49-51]和皱纹盘鲍[52-53], 其中Nie等[54]构建了皱纹盘鲍较高密度微卫星—着丝粒图谱,并与遗传图谱进行整合,定位了连锁群中着丝粒的位置。
目前,鲍染色体研究未有大的突破性进展,试验材料是主要限制因素。在制备染色体时,由于担轮幼虫期细胞分裂比较旺盛且容易观察而成为试验首选,但是受到繁殖期的制约。利用鳃或外套膜等组织则无季节限制,但分裂相相对较少。此外,鲍染色体长度相对较小,很多种类核型差异不大,区分难度大。以上因素都限制了鲍科染色体研究的顺利进行。
鲍的染色体研究相对于高等动物的相关研究还是比较匮乏和滞后的,除了染色体常规核型分析之外,染色体带型和荧光原位杂交应用主要局限于染色体C带、NOR带、端粒序列和rDNA定位方面的研究,大插入片段克隆的定位、遗传连锁图谱在细胞遗传图谱上的定位在鲍科中没有报道,染色体染色探针仍然缺乏。
随着细胞遗传学技术和分子生物学的快速发展,开展染色体研究的鲍物种的数目不仅会不断增多,而且染色体研究的精细程度也会不断加强。鲍染色体研究不再单单局限于核型、带型的分析,染色体图谱的绘制、高密度遗传连锁图谱与染色体图谱的整合、大片段基因组文库和相关功能基因在染色体上定位等将逐步开展研究,进一步阐述鲍遗传和系统进化机理。
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ResearchProgressonChromosomeinFamilyHaliotidae
GUO Zhansheng,HOU Xuguang
( College of Marine, Shandong University, Weihai 264209, China )
abalone; chromosome karyotype; chromosome banding; fluorescence in situ hybridization
10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.05.025
S917.4
C
1003-1111(2016)05-0597-06
2015-10-15;
2016-03-10.
山东省科技发展计划项目(2014GHY115014).
郭战胜(1987-),男,实验员,硕士;研究方向:贝类遗传育种.E-mail:guomarine@163.com.通讯作者:侯旭光(1963-),男,副教授,博士;研究方向:发育生物学.E-mail:richardhoukk@163.com.