脂联素通过干扰TLR4介导的炎症反应抑制血管平滑肌细胞泡沫化*

尹延伟，孙倩倩，张英谦，胡爱民，杨 芬，石 进△

(1.空军总医院神经内科，北京 100142;2.空军北京劲松干休所，北京100021;3.空军总医院急诊部，北京 100142)



·论 著·

脂联素通过干扰TLR4介导的炎症反应抑制血管平滑肌细胞泡沫化*

尹延伟1，孙倩倩2，张英谦1，胡爱民3，杨 芬1，石 进1△

(1.空军总医院神经内科，北京 100142;2.空军北京劲松干休所，北京100021;3.空军总医院急诊部，北京 100142)

目的 探讨脂联素(APN)抑制氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)泡沫化是否与干扰Toll样受体4(TLR4)及其介导的炎症反应相关。方法 组织贴块法培养C57BL/6J背景野生型及TLR4基因敲除(TLR4-/-)小鼠主动脉VSMCs。油红O染色观察VSMCs内脂质聚积；酶法检测VSMCs内胆固醇水平；Western blot检测VSMCs TLR4蛋白表达；ELISA方法检测VSMCs培养液中炎症因子IL-6和TNF-α的表达。结果 ox-LDL刺激VSMCs 48 h显著诱导细胞泡沫化；ox-LDL诱导VSMCs泡沫化过程中伴随着TLR4及其下游炎症因子IL-6、TNF-α表达的上调；而对于TLR4-/-型VSMCs，ox-LDL刺激并不能有效诱导VSMCs泡沫化及IL-6、TNF-α表达上调；APN显著抑制ox-LDL诱导的VSMCs泡沫化，伴随着TLR4及其下游炎症因子IL-6、TNF-α表达的下调。结论 APN可通过干扰TLR4介导的炎症反应抑制ox-LDL诱导的VSMCs泡沫化。

脂联素；Toll样受体4；血管平滑肌细胞；泡沫细胞

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是多种心脑血管疾病发生的病理基础，其以泡沫细胞在血管内皮下的大量堆积并伴随致炎因子的过度表达为特征[1]。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)是泡沫细胞的主要来源细胞之一。之前有研究发现脂联素(adiponectin,APN)参与AS过程中VSMCs的迁移、增殖与表型转化[2]。Toll样受体4(toll like recepter 4,TLR4)是启动免疫和炎性反应的重要膜受体，已证实激活TLR4介导的炎症反应可显著促进VSMCs的迁移、增殖与表型转化[3-4]。本研究旨在探讨APN是否可通过干扰TLR4介导的炎症反应抑制VSMCs泡沫化，为动脉粥样硬化的防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 C57BL/6J背景野生型小鼠购自第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心，C57BL/6J背景TLR4基因敲除(TLR4-/-)小鼠购自上海南方模式生物科技发展有限公司，SPF级饲养。实验用小鼠均为8周龄雄性小鼠，采用组织贴块法培养原代VSMCs[5]。将原代培养VSMCs分为对照组、ox-LDL组和APN+ox-LDL组。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

1.1.2 主要试剂 胎牛血清(FBS)、DMEM细胞培养液、抗生素、胰酶购自美国Hyclone公司；氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)购自广州奕源生物有限公司；油红O染料、APN购自美国Aldrich Sigma 公司；抗β-actin单克隆抗体(小鼠抗)、抗TLR4单克隆抗体(小鼠抗)购自美国Santa Cruz公司；辣根酶标记山羊抗小鼠IgG购自北京中杉生物技术公司；酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒(IL-6及TNF-α)购自美国R&D Systems公司。

1.2 方法

1.2.1 油红O染色 用异丙醇配制0.5%的油红O贮存溶液，与蒸馏水按照3∶2比例稀释成工作液。ox-LDL刺激细胞48 h后将VSMCs用磷酸盐缓冲液洗涤3次，10%多聚甲醛溶液固定20 min，加入油红O工作液，闭光染色30 min。60%异丙醇溶液脱色后镜下观察。

1.2.2 胆固醇水平的检测 细胞内总胆固醇水平依据Xue等[6]的报道方法进行检测。ox-LDL刺激细胞48 h后，将VSMCs收集到离心管中，加入100 μL异丙醇萃取细胞内脂质成分。超声破碎，1 500×g离心10 min。收集上清液，采用酶法测定的方法检测细胞内胆固醇水平。结果根据细胞蛋白水平进行标准化。

1.2.3 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测 ox-LDL刺激VSMCs 48 h后，常规提取细胞蛋白并定量检测。50 μg蛋白样品经SDS-PAGE凝胶电泳后，电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭液室温条件下封闭2 h。加一抗溶液(小鼠抗TLR4单克隆抗体，1∶1 000；小鼠抗β-actin单克隆抗体，1∶1 000)4 ℃孵育过夜，TBST溶液洗膜4次，每次10 min，加二抗溶液(辣根酶标记山羊抗小鼠IgG，1∶2 000)室温孵育2 h，TBST溶液洗膜4次，每次10 min，化学发光法曝光，Lab4.6软件对扫描结果进行分析。

1.2.4 ELISA检测 ox-LDL刺激VSMCs 48 h后，收集培养液，每孔加入50 μL检测稀释液RD1N；分别设定标准孔、对照孔、待测样品孔(每孔加入50 μL)；酶标板加上覆膜，室温孵育2 h；弃去液体，洗涤液洗涤5次；每孔加入100 μL IL-1β欧联物，加盖新的覆膜室温下孵育2 h；弃去液体，洗涤液洗涤5次；每孔加入100 μL底物溶液，室温孵育30 min，避光操作；每孔加入100 μL终止液，轻轻晃动混匀；30 min内用ELISA测定仪测定450 nm波长条件下每孔的光密度。

2 结 果

2.1ox-LDL显著促进VSMCs泡沫化 由图1油红O染色可见ox-LDL刺激明显诱导VSMCs泡沫化(图1A)；此外，细胞内脂质测定结果也显示ox-LDL刺激显著增加VSMCs中胆固醇水平(图1B)，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2ox-LDL通过激活TLR4介导的炎症反应促进VSMCs泡沫化 由图2可见ox-LDL刺激在显著诱导野生型VSMCs泡沫化的同时显著上调TLR4及其下游炎症因子IL-6、TNF-α的表达水平，差异均有统计学意义(P<0.05)；而对于TLR4-/-型VSMCs，ox-LDL刺激并不能有效诱导细胞泡沫化，同时，ox-LDL刺激也不能有效上调TLR4及其下游炎症因子IL-6、TNF-α的表达，差异均无统计学意义(P>0.05)。

A：油红O染色；B：胆固醇水平。*：P<0.05，与对照组比较。

图1 原代VSMCs泡沫化情况检测

A：油红O染色；B：胆固醇水平；C：TLR4表达；D：IL-6及TNF-α表达。*：P<0.05，与对照组比较；#：P<0.05，与ox-LDL组比较。

图2 原代VSMCs泡沫化情况及TLR4、IL-6、TNF-α表达水平的检测

2.3APN抑制ox-LDL诱导的VSMCs泡沫化 由图3可见APN预刺激2h明显抑制ox-LDL诱导的VSMCs泡沫化；此外，细胞内脂质测定结果也显示APN预刺激2h显著抑制ox-LDL刺激引起的VSMCs内胆固醇水平增加，差异有统计学意义(P<0.05)。

A：油红O染色；B：胆固醇水平。*：P<0.05，与对照组比较；#：P<0.05，与ox-LDL组比较。

图3 原代VSMCs泡沫化情况检测

2.4APN通过干扰TLR4介导的炎症反应抑制ox-LDL诱导的VSMCs泡沫化 由图4可见ox-LDL刺激可显著上调VSMCsTLR4及其下游炎症因子L-6、TNF-α的表达水平，差异均有统计学意义(P<0.05)；而用APN预刺激VSMCs2h后，ox-LDL刺激并不能有效上调TLR4及其下游炎症因子L-6、TNF-α的表达，差异均无统计学意义(P>0.05)。

A：TLR4表达；B：IL-6及TNF-α表达。*：P<0.05，与对照组比较；#：P<0.05，与ox-LDL组比较。

图4 原代VSMCsTLR4、IL-6、TNF-α表达水平的检测

3 讨 论

目前，AS目前已成为世界范围内严重威胁人类健康的重大公共卫生问题，尽管其发生、发展涉及非常复杂的病理过程，与年龄、性别、血脂异常、高血压、糖尿病、肥胖、吸烟、饮食、遗传、地理及气候等多种因素相关，但关于AS确切的发病机制目前仍不十分明确[7]。泡沫细胞在血管内皮下的大量沉积是AS的重要标志[1]。以往的观点认为巨噬细胞是泡沫细胞的主要来源，后来的研究显示，VSMCs也具有在细胞内聚积脂质并呈现泡沫细胞样变的能力，一些AS病变中的泡沫细胞实际上是发生了表型转化的VSMCs[8]。目前研究已证实VSMCs是中晚期AS病变中泡沫细胞的主要来源。因此，对平滑肌源性泡沫细胞形成的干预是延缓AS进程的重要环节。

以往观点认为，AS是一种退行性疾病，但近年来研究发现其同样是一种慢性炎症性疾病，AS的发生与发展始终伴随着炎症反应[9]。因此，近年来大量研究开始从炎症角度出发探索AS的发病机制。TLR4是广泛表达于人体细胞膜上的炎症相关蛋白分子，通过核因子κB(NF-κB)激活或JNK/SAPK激活途径介导下游炎症因子的表达，进而激活人体内炎症反应。近年来研究发现TLR4介导的炎性反应在VSMCs的迁移、增殖与表型转化中发挥重要作用[3-4]。在本实验中，用ox-LDL诱导VSMCs泡沫化，检测TLR4及其下游炎症因子IL-6、TNF-α的表达水平。研究发现ox-LDL刺激在明显诱导野生型VSMCs泡沫化同时显著上调TLR4及其下游炎症因子IL-6、TNF-α的表达水平，说明VSMCs泡沫化过程中伴随着TLR4介导的炎症反应激活。为了进一步验证以上结果，应用ox-LDL刺激TLR4-/-型VSMCs，结果显示TLR4缺陷损害ox-LDL的促泡沫化作用，这进一步说明TLR4介导的炎症反应在VSMCs泡沫化过程中的发挥重要作用。

APN是一种由分化中的脂肪细胞分泌的细胞因子，其不仅具有抗炎及改善胰岛素抵抗等活性，在抗AS方面也发挥重要作用。在本实验中，发现用APN预刺激VSMCs2h可显著抑制ox-LDL的促泡沫化作用，说明APN在阻碍平滑肌源性泡沫细胞形成方面具有重要作用，但其具体机制如何不得而知。有研究发现，APN可能具有通过干扰TLR4介导的炎症反应进而抑制巨噬细胞源性泡沫细胞形成的作用[10]。此外，APN还可以通过抑制VSMCs迁移、增殖与表型转化对AS的发展起到阻碍作用[2]。基于以上研究推测，APN可能具有通过干扰TLR4介导的炎症反应进而抑制平滑肌源性泡沫细胞形成的作用。为了验证以上假设，本文在前期实验基础之上进一步检测了TLR4及其下游炎症因子IL-6、TNF-α的表达水平，研究发现APN预刺激显著抑制ox-LDL诱导的TLR4激活及其下游炎症因子L-6、TNF-α的表达水平，说明APN可通过干扰TLR4介导的炎症反应抑制ox-LDL诱导的VSMCs泡沫化。

综上所述，本研究发现激活TLR4介导的炎症反应可促进VSMCs对脂质的摄取，APN可通过干扰以上炎症过程抑制VSMCs对脂质的摄取进而阻碍泡沫细胞的形成，进而在抗AS过程中发挥重要的作用。本研究从一个新的角度探讨了平滑肌源性泡沫细胞形成的分子机制。该研究将为AS的防治提供新的思路。

[1]YuXH,FuYC,ZhangDW,etal.Foamcellsinatherosclerosis[J].ClinChimActa,2013(424):245-252.

[2]StoletovK,FangLH,ChoiSH,etal.Vascularlipidaccumulation,lipoproteinoxidation,andmacrophagelipiduptakeinhypercholesterolemiczebrafish[J].CircRes,2009,104(8):952-960.

[3]ZhangLL,GaoCY,FangCQ,etal.PPARγattenuatesintimalhyperplasiabyinhibitingTLR4-mediatedinflammationinvascularsmoothmusclecells[J].CardiovascRes,2011,92(3):484-493.

[4]DeGraafR,KloppenburgG,KitslaarPJ,etal.Humanheatshockprotein60stimulatesvascularsmoothmusclecellproliferationthroughToll-likereceptors2and4[J].MicrobesInfect,2006,8(7):1859-1865.

[5]曹小洁，张莉莉，郭露，等．oxLDL通过PPARγ-ABCG1通路促进血管平滑肌细胞泡沫化[J]．第三军医大学学报，2015，37(4)：325-329．

[6]XueJH,YuanZ,WuY,etal.Highglucosepromotesintracellularlipidaccumulationinvascularsmoothmusclecellsbyimpairingcholesterolinfluxandeffluxbalance[J].CardiovascRes,2010,86(1):141-150.

[7]GaleslootTE,JanssLL,BurgessS,etal.Ironandhepcidinasriskfactorsinatherosclerosis:whatdothegenessay?[J].BMCGenet,2015,16(1):79.

[8]DoranAC,MellerN,McnamaraCA.Roleofsmoothmusclecellsintheinitiationandearlyprogressionofatherosclerosis[J].ArteriosclerThrombVascBiol,2008,28(5):812-819.

[9]YinYW,LiaoSQ,ZhangMJ,etal.TLR4-mediatedinflammationpromotesfoamcellformationofvascularsmoothmusclecellbyupregulatingACAT1expression[J].CellDeathDis,2014(5):1574.

[10]WangM,WangD,ZhangY,etal.Adiponectinincreasesmacrophagescholesteroleffluxandsuppressesfoamcellformationinpatientswithtype2diabetesmellitus[J].Atherosclerosis,2013,229(1):62-70.

Adiponectin inhibits foam cell formation of vascular smooth muscle cell by interfering TLR4-mediated inflammation reaction*

YinYanwei1,SunQianqian2,ZhangYingqian1,HuAimin3,YangFen1,ShiJin1△

(1.DepartmentofNeurology,AirForceGeneralHospital,Beijing100142,China;2.JinsongSanatoriumofBeijingAirForce,Beijing100021,China;3.DepartmentofEmergency,AirForceGeneralHospital,Beijing100142,China)

Objective To investigate whether adiponectin(APN)inhibiting oxidized low density lipoprotein(ox-LDL)induced foam cell formation of vascular smooth muscle cells(VSMCs)is associated to interfere toll like recepter 4(TLR4)and its mediated inflammation reactions.Methods Primary VSMCs were isolated from the thoracic aorta of the male(C57BL/6J)wild-type mice and TLR4 knockout(TLR4-/-)mice.Oil red O staining was used to observe the intracellular lipid deposition in VSMCs;enzymatic assay was used to analyze the intracellular total cholesterol content in VSMCs;the expression of TLR4 in VSMCs was detected by Western blot;the levels of IL-6 and TNF-α in the VSNCs culture solution were quantified by using ELISA.Results Ox-LDL stimulating VSMC for 48 h significantly induced its foam cell formation,and this process was accompanied by the up-regulation of TLR4,downstream inflammatory factors IL-6 and TNF-α expression;however,in TLR4-/- VSMCs,the ox-LDL stimulation failed to effectively induce the VSMC foam cell formation,as well as the expression up-regulation of IL-6 and TNF-α;APN significantly inhibited the ox-LDL induced-VSMC foam cell formation,and down-regulated the expressions of TLR4,IL-6 and TNF-α.Conclusion APN could inhibit ox-LDL induced VSMC foam cell formation by interfering TLR4 mediated inflammation reaction.

adiponectin;Toll like recepter 4;vascular smooth muscle cell;foam cell

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.32.001

全军医学科技青年培育项目基金资助(13QNP080)。 作者简介：尹延伟(1982-)，主治医师，博士，主要从事动脉粥样硬化性心脑血管疾病防治与研究。△

R543.5

A

1671-8348(2016)32-4465-03

2016-04-02

2016-05-15)