内质网应激相关蛋白与CXCL12蛋白在特发性肺纤维化中的表达及意义

金 笛，何 丽，张海锋

(1.湖北中医药高等专科学校内科教研室，湖北荆州 434020；2.湖北省荆州市中心医院呼吸内科 434020；3.湖北省荆州市第二人民医院呼吸内科 434000)



内质网应激相关蛋白与CXCL12蛋白在特发性肺纤维化中的表达及意义

金 笛1，何 丽2，张海锋3△

(1.湖北中医药高等专科学校内科教研室，湖北荆州 434020；2.湖北省荆州市中心医院呼吸内科 434020；3.湖北省荆州市第二人民医院呼吸内科 434000)

目的 探讨内质网应激相关蛋白及CXCL12在特发性肺纤维化中的表达及意义。方法 收集荆州市中心医院2004～2014年诊断为特发性肺纤维化且存有活检或手术标本的患者共18例，并收集正常肺组织20例作为对照，通过蛋白免疫印迹法(Western blot)检测内质网应激相关蛋白(GRP78、CHOP)及CXCL12蛋白(SDF-1)的表达，通过逆转录PCR(RT-PCR)检测肺组织中GRP78mRNA及CXCL12mRNA的表达。结果 与对照相比，肺纤维化患者肺泡上皮中GRP78、CHOP、CXCL12蛋白表达均上调，且GRP78mRNA及CXCL12mRNA也表达上调。 结论 内质网应激相关蛋白及CXCL12在特发性肺纤维化的发病过程中起重要作用，可能参与了特发性肺纤维化的发生与发展。

特发性肺纤维化；内质网应激；GRP78；CHOP；CXCL12

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一组由多种病因所致的慢性肺间质纤维化疾病，是临床中最常见的特发性间质性肺炎(idiopathic interstitial pneumonia，IIP)，组织病理学表现为普通型间质性肺炎(usual interstitial pneumonia，UIP)。其发病率随年龄的增加而明显上升，但其发病机制仍不清楚，且对传统治疗方法反应性差，大多数患者中位生存时间仅为3年，患者往往死于渐进性呼吸困难和呼吸衰竭[1-3]。近年来研究显示氧化应激、基因突变、上皮间质转化、TGF-β激活可能均参与了肺纤维化的发病过程[4-6]。内质网是十分重要的细胞器，和高尔基体共同参与了分泌蛋白和膜蛋白的生成、折叠和包装。当细胞对蛋白合成的需求与内质网蛋白生成能力不平衡时就会发生内质网应激(endoplas-mic reticulum stress，ERS)，当内质网功能持续紊乱，细胞将最终启动Caspase12依赖的细胞凋亡程序，最终参与疾病的发生、发展。已有研究显示其在心血管、肝脏及癌症等疾病的发生、发展过程中具有重要作用，但ERS在IPF中的研究较少[7]。CXCL12是一种小分子的细胞因子，属于CXC趋化因子家族，纤维细胞可表达细胞因子受体CXCR4和CCR2，CXCL12是CXCR4的配体，通过配体结合可以募集纤维细胞并参与纤维化的进程[8]。本研究收集临床及病理诊断为IPF的患者标本，观察肺组织中ERS相关蛋白及CXCL12的表达情况，探讨其在IPF中的作用及可能的机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 (1)样本获得：收集荆州市中心医院病理科2004～2014年档案中由临床及病理学诊断为IPF的病例18例(IPF组)，并收集正常肺组织20例作为对照组。诊断结果采用单盲法，由两名高级职称病理医师进行复核，实验材料安全可靠。(2) 试剂和仪器：GRP78及CXCL12抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，CHOP抗体购自Santa Cruz公司；与一抗相对应的二抗购自北京中杉金桥生物技术生物技术有限公司。石蜡组织蛋白提取试剂盒购自上海信裕生物科技公司，ECL显色试剂盒购自GE公司，mRNA提取及逆转录扩增采用试剂盒购自Invitrogen Life Technology公司。其余采用试剂均为国产分析纯产品并按相应配方规范配制。紫外分光光度计及梯度PCR仪购自德国Eppendorf公司，电泳仪及电泳槽购自美国Bio-Rad公司，凝胶成像系统购自美国Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 组织总蛋白制备 复诊筛选后病例石蜡包埋组织按7μm厚切取10张石蜡切片，置于1.5mL EP管内；加入1.2mL二甲苯脱蜡3次，用1.2mL无水乙醇清洗3次，弃去上层液体后开盖置于37℃温箱内干燥20min。用超声波匀浆器在冰浴中间歇匀浆至离心管中混合液无明显沉淀。按石蜡组织蛋白提取试剂盒说明书提取蛋白并测定浓度。

1.2.2 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测 按测定浓度取50μg蛋白通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(恒定电压100V)，将蛋白质电转移至硝酸纤维膜上(恒定电流200mA,120min)。一抗为兔抗GRP78多克隆抗体、兔抗CHOP多克隆抗体、兔抗CXCL12多克隆抗体；二抗为HRP-羊抗兔抗体，ECL试剂盒显色。内参为GAPDH。

1.2.3 RNA提取[9]所用实验玻璃器皿常规清洗浸泡后，置于180℃烤箱中烘烤8h，塑料制品置于0.1%DEPC溶液中浸泡12h后高压消毒(121℃，30min)以去除RNA酶干扰。切片机用0.1% DEPC溶液充分清洁，取用0.1% DEPC溶液浸泡的一次性刀片，按5μm厚切取10张石蜡切片，置于RNA酶灭活后的1.5mL EP管内；加入1.2mL二甲苯脱蜡3次，每次离心(9000r/min，10min)后均弃去上层液体，用1.2mL无水乙醇清洗3次(离心9000r/min，10min)，弃去上层液体后开盖置于37℃温箱内干燥20min。加入组织裂解液250μL混匀，加入蛋白酶K(终浓度300mg/L)，置于58℃水浴摇床中消化。消化后的组织在95℃水浴中灭活蛋白酶K(10min)。组织处理完成后，按照试剂盒说明提取总RNA。

1.2.4 RNA浓度测定及逆转率扩增 紫外分光光度计测定RNA浓度，取1μg总RNA进行逆转录PCR(RT-PCR)，以GAPDH作为内对照，逆转录过程按试剂盒说明进行。引物序列如下，GRP78正义链5′-AAG GTG AAC GAC CCC TAA CAA A-3′,反义链5′-GTC ACT CGG AGA ATA CCA TTA ACA TCT-3′；CXCL12正义链 5′-CAC CAT TGA GAG GTC GGA AG-3′,反义链5′-AAT GAG ACC CGT CTT TGC AG-3′;GAPDH 正义链 5′-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GA-3′，反义链5′-TTC ACC ACC ATG GAG AAG GC-3′。产物进行2%琼脂糖电泳，溴化乙锭染色后置于凝胶成像分析系统内观察。

2 结 果

2.1 GRP78、CHOP表达 与对照组相比，IPF组患者肺纤维化区域表达内质网应激蛋白相关蛋白CHOP、GRP78表达上调，二者差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

2.2 CXCL12表达 与正常肺组织相比，特发性纤维化患者中肺泡上皮CXCL12蛋白表达明显上调，二者差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

2.3 GRP78mRNA及CXCL12mRNA表达 与对照组相比，IPF组区域GRP78mRNA及CXCL12mRNA表达增加，且二者均差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

图1 内质网应激相关蛋白表达

图2 CXCL12蛋白表达

图3 GRP78mRNA及CXCL12mRNA表达

3 讨 论

IPF是以肺泡上皮损伤、成纤维细胞灶形成、细胞外基质聚集为病理特征的一组肺间质性疾病。其发病机制尚不清楚，可能与感染、药物、理化刺激、自身免疫性疾病有诱因有关。IPF目前没有特异性的治疗方法，预后很差。近年的研究显示，IPF患者病灶区域肺泡上皮的内质网应激反应增强。内质网应激启动的凋亡途径是一种新的细胞凋亡途径，这一点也和IPF发病假说中上皮细胞/间质细胞假说相互印证[10]。本研究结果也发现，与对照组相比，IPF患者病灶区域肺泡上皮内质网应激相关蛋白CHOP及GRP78表达明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。这也提示了内质网应激在IPF发病过程中发挥了相应的作用。

在IPF发病过程，纤维细胞起到了较为重要的作用，纤维细胞可以直接产生细胞外基质(如Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原)，可以分化为纤维母细胞和肌纤维母细胞，可以产生促胶原沉积的细胞因子，这些均参与了纤维化的发病过程。在IPF患者的血液循环及肺实质内中可以发现纤维细胞。血液循环中纤维细胞的数量和患者的预后呈相关性。在纤维细胞募集过程中，肺泡上皮细胞可能起到了关键作用。纤维细胞表面表达细胞因子受体CXCR4，而CXCL12作为CXCR4的配体可以参与纤维细胞的募集[11]。以往的研究主要集中在内质网应激诱导细胞凋亡、造成组织损伤，促进肺纤维化发病这一方面。本研究探讨了内质网应激相关蛋白表达上调时CXCL12的表达情况，结果显示，与对照组相比，IPF组病灶内肺泡上皮CXCL12表达明显上调，这一结果显示肺泡上皮细胞可能通过CXCR4/CXCL12轴募集纤维细胞参与特发性肺纤维化的发病过程。

此外，内质网应激相关蛋白和CXCL12共同表达上调也提示内质网应激可能刺激了趋化因子的表达，进一步促进肺纤维化的发生、发展。有研究显示，内质网应激可以促进乳腺癌MCF-7细胞CCL5表达上调，增加肿瘤细胞的运动、侵袭和转移能力，但具体机制尚不清楚[12]。通过RT-PCR检测肺组织中GRP78mRNA及CXCL12mRNA的表达结果显示，肺纤维化区域GRP78mRNA及CXCL12mRNA表达增高，这说明GRP78、CXCL12蛋白的表达提高，同时编码该蛋白的mRNA也升高，可能是由于GRP78、CXCL12的转录活性被激活所致。

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Expression and significance of endoplasmic reticulum stress associated protein and CXCL12protein in the pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis

Jin Di1，He Li2，Zhang Haifeng3△

(1.Teaching and Research Division of Internal Medicine，Hubei College of Chinese Medicine，Jingzhou，Hubei 434020,China；2.Department of Respiratory Medicine，Jingzhou Central Hospital，Jingzhou，Hubei 434020，China；3.Department of Respiratory Medicine，the Second Hospital of Jingzhou，Jingzhou，Hubei 434000，China)

Objective To investigate the expression and role of endoplasmic reticulum stress associated protein and CXCL12protein in the pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis(IPF).Methods From 2004to 2014,lung tissues from idiopathic pulmonary fibrosis patients(n=18) and normal persons(n=20,control) of Jingzhou Central Hospital， were used for detecting the expression of GRP78,CHOP and CXCL12protein by Western blot,and used for detecting the expression of GRP78mRNA and CXCL12mRNA by RT-PCR.Results The expression of GRP78,CHOP and CXCL12protein was up-regulated in idiopathic pulmonary fibrosis patients,also the expression of GRP78mRNA and CXCL12mRNA were higher in patients than normal tissue.Conclusion Endoplasmic reticulum stress related proteins and CXCL12play an important role in the pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis,which may be involved in the occurrence and development of idiopathic pulmonary fibrosis.

idiopathic pulmonary fibrosis；endoplasmic reticulum stress；GRP78，CHOP；CXCL12

金笛(1974-)，副教授,硕士，主要从事哮喘、肺纤维化研究。△

论著·临床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.29.012

R563.9

A

1671-8348(2016)29-4068-03

2016-02-20

2016-04-08)