人HCN4基因真核表达质粒构建及在HEK293细胞中的表达

谢向荣，左广锋，程 浪，汪 茗，曹 蘅，汪和贵，蔚有权，杨 浩，芮世宝，杨玉雯，汤圣兴

(1.皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 心内科，安徽 芜湖 241001；2.皖南医学院 活性生物大分子研究安徽省重点实验室，安徽 芜湖 241002；3.南京医科大学附属南京医院 心内科，江苏 南京 210006)



·基础医学·

人HCN4基因真核表达质粒构建及在HEK293细胞中的表达

谢向荣1，2，左广锋3，程 浪2，汪 茗2，曹 蘅1，汪和贵1，蔚有权1，杨 浩1，芮世宝1，杨玉雯1，汤圣兴1

(1.皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 心内科，安徽 芜湖 241001；2.皖南医学院 活性生物大分子研究安徽省重点实验室，安徽 芜湖 241002；3.南京医科大学附属南京医院 心内科，江苏 南京 210006)

目的：构建人HCN4基因的真核表达质粒并转染人胚胎肾细胞，建立异源性表达HCN4通道模型。方法：通过聚合酶链反应扩增人HCN4基因全长核苷酸序列，双酶切(XhoI和EcoRI)后插入真核表达质粒pIRES2-EGFP中，构建重组真核表达质粒pIRES2-HCN4-EGFP。应用脂质体法将重组质粒pIRES2-HCN4-EGFP转染入HEK293细胞中进行表达。全细胞膜片钳技术检测HCN4通道电流。结果：酶切及测序的结果显示pIRES2-HCN4-EGFP构建成功，倒置荧光显微镜能观察到EGFP绿色荧光，反转录-聚合酶链反应检测到HCN4 mRNA表达，膜片钳检测到HCN4基因编码的通道电流。结论：成功建立异源性表达HCN4通道模型，为进一步研究HCN4通道电生理特性提供了实验基础。

HCN4基因；转染；异源性表达；HEK293细胞

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.06.001

正常心脏节律的产生取决于起搏细胞4相自动除极化，而If电流在此除极化过程中起着重要作用[1]。If电流由超极化激活的环核苷酸门控通道(HCN通道)开放产生，该通道由HCN基因编码，其电生理特性是超极化时被激活，呈电压和时间依赖性，为非选择性的内向阳离子通道[2]。目前已知HCN基因共有四个亚型，分别为HCN1～HCN4，这四个基因亚型分别编码具有不同电生理特性及不同组织分布的HCN1～HCN4通道。心脏中的起搏细胞主要表达HCN4，该通道占总HCN mRNA的80%以上[3-4]，主要调节心率[5]。最近研究发现，严重的缓慢性心动过缓与HCN4基因某些位点突变相关[6-8]。通过基因工程构建生物起搏器来根治严重的缓慢性心动过缓，理想的基因表达载体不可或缺。因此，HCN4基因表达载体的构建成为重要的研究手段。本研究通过构建人HCN4基因的重组真核表达载体pIRES2-HCN4-EGFP，应用分子生物学及膜片钳技术检测pIRES2-HCN4-EGFP在HEK293细胞中的表达，以期建立异源性表达HCN4通道模型，为该通道的功能研究及缓慢性心律失常疾病的基因治疗等提供了实验基础，同时也为该通道的药物干预研究提供了实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料 HEK293细胞(中国科学院上海细胞库)；无内毒素质粒大量提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒(QianGEN)；反转录-聚合酶链反应试剂盒、pMD-18T载体(Takara)；PCR试剂盒、DNA上样缓冲液及琼脂糖凝胶(南京凯基)；胰化蛋白胨、酵母提取物(Oxoid)；限制性内切酶XhoI、EcoRI，T4 DNA 连接酶(NEB)；胎牛血清及高糖DMEM培养基(Gibco)；Fugene HD转染试剂(Roche)；pIRES-EGFP质粒、大肠杆菌DH5α感受态细胞、DNA marker、 Platinum Pfx DNA聚合酶、Taq Polymerase、dNTP、MgSO4、Trizol均为Invitrogen公司产品。

1.2 方法

1.2.1 HCN4基因的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增 根据GenBank报道的人HCN4基因的全长序列(NM_005477.2)设计单链oligo引物，并在正向引物和反向引物中分别添加EcoRI、XhoI两个酶切位点，引物由Invitrogen公司合成。寡聚单链核苷酸进行两轮PCR扩增。其中第一轮PCR反应条件为：95℃ 3 min 1 cycle；95℃ 20 s，55℃ 20 s，68℃ 1 min，25 cycles；68℃ 5 min 1 cycle。第二轮PCR反应条件为：95℃ 3 min 1 cycle；95℃ 20 s，60℃ 20 s，68℃ 1 min，25 cycles；68℃ 5 min 1 cycle。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后进行回收纯化。

1.2.2 测序及HCN4基因拼接 将连接pMD-18T载体与回收纯化的PCR产物，转化DH5α感受态细胞，采用含氨苄青霉素的平板进行筛选，次日挑单克隆后摇菌，最后提取质粒并测序，鉴定插入片段的序列与目的序列是否一致。应用重叠PCR技术将插入片段拼接成完整的HCN4基因，并进行扩增。扩增条件为：95℃ 3 min 1 cycle；95℃ 40 s，60℃ 40 s，68℃ 3 min 40 s，25 cycles；68℃ 10 min 1 cycle。扩增产物再次采用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收纯化。

1.2.3 重组质粒pIRES2-HCN4-EGFP的构建XhoI和EcoRI双酶切带有相应酶切位点的HCN4基因和pIRES2-EGFP载体，回收HCN4片段和线性pIRES2-EGFP，用T4 DNA连接酶连接HCN4和pIRES2-EGFP。连接体系为：双酶切HCN4基因5 μL,双酶切pIRES2-EGFP载体 3 μL，10Х连接酶缓冲液1 μL，连接酶0.5 μL，双蒸水0.5 μL。构建的pIRES2-HCN4-EGFP重组质粒采用双酶切、PCR、测序等方法进行验证，确定构建成功后扩增备用。

1.2.4 pIRES2-HCN4-EGFP质粒的瞬时转染 HEK293细胞采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，置于37℃，5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。倒置显微镜下观察细胞生长情况，2～3 d传代1次，消化时采用0.25%的胰酶-EDTA消化液。质粒转染参考既往文献[9]中的方法进行，48 h后采用倒置荧光显微镜观察转染细胞的EGFP绿色荧光，确定转染效率。

1.2.5 HCN4基因转录水平的检测 参考既往文献[9]中的方法收集HEK293细胞，提取总RNA，进行逆转录、基因扩增，最后用1.5%琼脂糖110 V，15 min凝胶电泳进行分析。hHCN4上游引物：5′-CCCGCCTCATTCGATATATTCAC-3′，hHCN4下游引物：5′-GAGCGCGTAGGAGTACTGCTTC-3′。

1.2.6 电生理实验 HEK293细胞转染pIRES2-HCN4-EGFP质粒48 h后，采用全细胞膜片钳技术记录单细胞的HCN4通道电流。所有电生理操作均在室温(20～25℃)下进行，按照文献[10]中的方法进行数据采集及分析。

2 结果

2.1 HCN4基因扩增及pIRES2-HCN4-EGFP质粒测序XhoI和EcoRI双酶切pIRES2-HCN4-EGFP重组质粒，采用1%的琼脂糖凝胶进行电泳(电压110 V，时间15 min)，凝胶成像后可见一条与目的基因(3612bp)位置相符的条带(如图1所示)。测序结果经NCBI blast比对后，序列一致，其中序列号为NM_005477.2(如图2所示)。

M：DNA Marker；1:HCN4基因。

图1 扩增带有酶切位点的HCN4基因

图2 pIRES2-HCN4-EGFP质粒基因测序结果

2.2XhoI和EcoRI双酶切pIRES2-HCN4-EGFP质粒XhoI和EcoRI双酶切鉴定结果可知pIRES2-HCN4-EGFP质粒被切成长度为5.3 kb的载体和3.6 kb的DNA片段，提示质粒构建的完全正确(如图3所示)。

1:重组质粒被切成载体(5.3 kb)和3.6 kb的DNA片段;M：DNA Marker。

图3XhoI和EcoRI双酶切重组质粒pIRES2-HCN4-EGFP

2.3 EGFP表达检测 通过倒置荧光显微镜观察，转染携带有EGFP质粒的HEK293细胞均可见绿色荧光，提示转染成功。而未转染质粒的HEK293细胞则未见绿色荧光(如图4所示)。

a.转染pIRES2-HCN4-EGFP质粒的HEK293细胞；b.转染pIRES2-EGFP质粒的HEK293细胞;c.未转染质粒的HEK293细胞。转染pIRES2-HCN4-EGFP质粒和转染pIRES2-EGFP质粒的HEK293细胞均可见绿色荧光，未转染HEK293细胞未见绿色荧光表达。

图4 转染及未转染的HEK293细胞荧光显微镜特点

2.4 转染细胞的HCN4 mRNA表达 应用RT-PCR方法，提取HEK293细胞总的RNA，经逆转录后获取cDNA并进行扩增，凝胶电泳结果显示pIRES2-HCN4-EGFP组扩增出大约233 bp的目的片段，而pIRES2-EGFP组和未转质粒组则无相应条带，表明导入的异源性人HCN4基因(hHCN4)已转录出相应的mRNA(如图5所示)。

1：pIRES2-HCN4-EGFP组；2、3：pIRES2-EGFP组；4、5：未转质粒组；M：DNA Marker。

图5 RT-PCR检测HCN4在转基因细胞中的转录

2.5 异源性hHCN4通道电流的记录 转染pIRES2-HCN4-EGFP质粒的HEK293 细胞48 h后均可记录到超极化激活的内向电流，并呈现出电压依赖性(见图6)，提示表达hHCN4通道蛋白，进一步证实了异源性hHCN4基因在HEK293 细胞中的表达。pIRES2-EGFP组和未转质粒组则未检测出电流。

3 讨论

目前，HCN家族有HCN1～HCN4四个亚型，其在鼠及人等哺乳动物中已经被克隆且得到广泛的研究[11-12]，这一家族各亚型在组织分布、电生理特性、生理功能、不同动物种属中的表达均不相同。HCN4是已知成年人窦房结中最主要的亚型，介导了在窦房结起搏活动中的关键因素If电流，因此相应的HCN4基因的突变也和严重的缓慢性心律失常密切相关[13]。

a：克隆hHCN4通道的I/t关系曲线；b：对照组未引出电流。

图6 膜片钳技术记录hHCN4通道电流

近年来很多研究显示了HCN4基因在形成心脏节律及控制心率中起着至关重要的作用：①胚胎期HCN4基因敲除的大鼠心率减少40%，缺少对cAMP的反应并最终死于子宫内[14-15]；②全HCN4基因敲除的成年小鼠可出现严重的心动过缓、房室传导阻滞，甚至在第5天左右出现心脏骤停及死亡[16]；③在研究遗传性窦房结功能障碍的患者中发现，严重的缓慢性心律失常与HCN4 点突变(D553N或1613delC位点)密切相关[6-8]。

目前，治疗缓慢性心律失常的主要方法仍是在心脏中植入人工起搏器，虽然该方法具有很好的稳定性，但它存在使用寿命有限、费用昂贵、不受神经体液调节等缺点，因此，科研工作者开始探讨生物起搏治疗的可能。HCN4基因是HCN家族参与心脏节律形成的最重要的亚型，因此可以作为基因治疗缓慢性心律失常的靶基因。但HCN4通道电生理特性及其对众多药物(尤其是抗心律失常药物)的干预反应仍未充分研究，故需构建异源性HCN4通道模型，在此模型上进行电生理及药物干预研究，为上述HCN4靶基因治疗缓慢性心律失常提供更多的理论依据及实验基础。国内外关于HCN4基因的构建及转染表达的研究多应用于实验动物细胞，由于HCN4基因在不同动物种属中的表达均不相同，因此本研究系构建人HCN4基因的真核表达质粒，并在人胚胎肾细胞中表达，对于人体的生物起搏治疗具有更高的医学研究价值。

本研究构建的pIRES2-EGFP-HCN4真核表达载体能有效地将hHCN4导入HEK293细胞中，通过荧光显微镜观察绿色荧光可明确转染成功，并进一步通过RT-PCR方法和膜片钳技术分别检测了hHCN4的mRNA和通道蛋白的表达，表明成功建立了hHCN4基因异源性表达模型。该模型的建立为研究hHCN4通道的电生理特性及其对药物干预的反应提供了广阔的平台，也为今后起搏通道基因治疗窦房结功能障碍提供理论依据，并为后续的在体生物起搏器开发研究奠定了基础。

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Construction of human HCN4 gene eukaryon expression vector and its expression in HEK293 cells

XIE Xiangrong，ZUO Guangfeng，CHENG Lang，WANG Ming，CAO Heng，WANG Hegui，YU Youquan，YANG Hao，RUI Shibao，YANG Yuwen，TANG Shengxing

Department of Cardiology，The First Affiliated Hospital of Wannan Medical College，Wuhu 241001，China

Objective：To construct eukaryon expression vector of human HCN4 gene and transfect it into human embryonic kidney cells (HEK293).Methods：cDNA encoding human HCN4 gene was amplified by polymerase chain reaction,then digested with the restriction endonucleasesXho1 andEcoR1 and inserted into eukaryotic expressing vector pIRES2-EGFP that was transfected into HEK293 cells by Fugene HD.Whole-cell patch clamp indicated that hHCN4 gene was transfected into HEK293cells.Results：Double enzyme digestion and DNA sequencing confirmed that the HCN4 gene was completely accurate.GFP was observed in the transfected 293 cells under a fluorescent microscope.HCN4 mRNA expression was confirmed by RT-PCR.Whole-cell patch clamp recorded ionic currents of transfected HCN4.Conclusion：The pIRES-HCN4-EGFP eukaryon expression vector was successfully constructed,and pacemaker channel HCN4 gene heterologous expression was established.

HCN4 gene；transfection；heterologous expression；HEK293 cell

1002-0217(2016)06-0511-05

安徽高校省级自然科学研究项目(KJ2013Z340；KJ2016A728)；活性生物大分子研究安徽省重点实验室自主研究课题(LAB201403，LAB201401)；安徽省大学生创新训练计划项目(AH201410368150)

2016-06-16

谢向荣(1981-)，男，主治医师，讲师，(电话)13966032437，(电子信箱)xxr200611@sina.com; 汤圣兴，男，主任医师，教授，硕士生导师，(电子信箱)tsx2229@163.com，通信作者.

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