食品中沙门氏菌检测方法比较

王歆睿 姜 薇

(辽宁省分析科学研究院 辽宁 沈阳)

食品中沙门氏菌检测方法比较

王歆睿 姜 薇

(辽宁省分析科学研究院 辽宁 沈阳)

本文运用国标微生物培养方法和PCR法对多个人工污染食品样本进行检测，从准确性、灵敏度、检测成本和检测周期几方面对检测方法进行比较。PCR技术具有敏感高、检测周期短等优点,同时PCR技术检测成本高，不适合大批样品的检测。

沙门氏菌 检测 PCR 食品

前言

沙门氏菌属是肠杆菌科中最重要的一个属[1]。它是引起人类沙门氏菌食物中毒的主要致病菌[2]，引起急性胃肠炎和伤寒等烈性传染病，对食品安全构成了严重威胁，国家不断加强对食品中致病菌的监管，因此对食品中沙门氏菌检测技术的研究十分关键。沙门氏菌的检测一般有传统的培养技术，免疫学技术和PCR检测技术三个方法[3]。传统微生物培养技术是将样本经过预增菌、选择性增菌、选择性培养、生化鉴定血清学鉴定与分群四个步骤，做出鉴定。一般需要4~7天，才能得出明确的结果[4]。PCR法检测食品中沙门氏菌是利用游离的脱氧核糖核苷酸（dNTP），以目标基因组DNA上正、反相两引物间的某一区段为模板进行快速扩增，电泳观察结果[5]，可以在12小时内快速检测沙门菌。本文分别用国标方法和PCR方法对多个样本进行检测，从准确性和灵敏度两方面对这两种检测方法进行比较。

1、材料和方法

1.1.实验材料

1.1.1 样品

鸡蛋15份，各养鸡场送检；配合饲料10份，饲料公司送检；牛奶 8份，购于超市。

1.1.2

沙门氏菌标准菌株

1.1.3 试剂

缓冲蛋白胨水（BPW）实验室自制；四硫磺酸钠黄绿（TTB）增菌液，亚硒酸胱氨酸（SC）增菌液；亚硫酸铋（BS）琼脂，沙门氏菌显色培养基，沙门氏菌生化鉴定盒，沙门氏菌O和H诊断血清，均购于广东环凯微生物科技有限公司。沙门氏菌核酸扩增检测试剂盒，购于北京索奥生物技术有限公司。引物：引物序列为P1:5’-CTC ACC AGG AGA TTA CAA CAT GG-3’,P2:5’-AGC TCA GAC CAA AAG TGA CCA TC-3’。

1.2 仪器设备

ABI 2720型 PCR仪、全自动高压灭菌器、Dynamica DNA master核酸蛋白分析仪、恒温培养箱、WEALTEC凝胶成像系统。

1.3 国标微生物培养方法

1.3.1 沙门氏菌标准菌株复苏后制成菌悬液,菌悬液浓度1.0×104 CFU/mL，依次稀释菌悬液浓度分别为1.0，2.0，5.0，10.0 CFU/mL。吸取各浓度菌悬液1mL污染样品。

1.3.2 前增菌：称取样品25g放入无菌均质袋中，加入225mL缓冲蛋白胨水（BPW）用均质器拍打50秒，置于培养箱内36℃培养18小时。

1.3.3 增菌 移取1mL前增菌液，分别接种于10mL四硫磺酸钠黄绿（TTB）增菌液和10mL亚硒酸胱氨酸（SC）增菌液内，分别置于不同培养箱中42℃（TTB）36℃（SC）培养24小时。

1.3.4 分离培养：分别用接种环取增菌液1环，划线接种于沙门氏菌显色培养基。

36℃培养24小时，观察平板上菌落生长情况。在沙门氏菌显色培养基平板上典型沙门氏可疑菌落呈现光滑、略凸起，直径1~3mm，边缘整齐的品红菌落。

1.3.5 生化鉴定：将可疑菌落用0.85%无菌生理盐水稀释至109 CFU /mL,吸取一到两滴菌悬液接种到各西林瓶内，在培养箱中36℃培养24小时后观察反应情况。

1.3.7 血清型鉴定 按照沙门氏菌诊断血清操作说明书进行反应。A-F型多价血清菌体试验结果分类：阳性反应，混合物试验凝集，而在盐水对照中不凝集。阴性反应, 混合物试验不凝集，而在盐水对照中也不凝集。

1.4 PCR检测方法

1.4.1 样品DNA的提取：将增菌液用12000r/min离心3min，收集沙门氏菌菌体，倒去上清液，灭菌生理盐水洗涤2次，用灭菌去离子水悬浮，隔水煮沸15min，12000r/min离心3min，取上清液作为DNA模板溶液。

1.4.2 PCR反应体系：反应体系（25μ L）含10×PCR Taq酶缓冲液2.5μ L，引物（10ol/L）1μ L，dNTP（2.5 mmol/L）1μ L，MgCl2（25 mmol/L）1.5μ L，Taq DNA合酶（1 U/μ L，）1μ L，DNA模板5μ L，灭菌双蒸水13μ L。

PCR循环参数：94℃预变性3 min；接着作35个循环，每个循环包括94℃变

性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s；循环结束后72℃延伸10 min。

1.4.3 电泳检测：取5μ L PCR扩增产物与1μ L上样缓冲液混匀，分别点样于2%琼脂糖凝的点样孔中，以100bp DNALadder为分子量标准，70 V电压电泳1 h，经EB染色后，用凝胶成像仪成像并观察结果。

2、结果与分析

2.1 样品检测结果

共33份样品，用浓度为10.0CFU/mL沙门氏标准菌株菌悬液人工污染样品，分别用微生物培养和PCR法检测，结果如表1所示。

表1 人工污染菌样品微生物培养和PCR检测结果（菌液浓度10.0 CFU/mL）

微生物培养法阳性检出率为100%，PCR法样品的阳性检出率也可以达到100%。

经人工污染的5份无菌牛奶样品，菌悬液浓度分别为0、1.0、2.0、5.0、10.0 CFU/mL，国标微生物培养法检测结果，菌悬液浓度1.0 CFU/mL的污染样品结果为阴性，其他浓度为阳性。PCR法检测结果，5份污染样品均为阳性。

3、讨论

对人工污染的33份鸡蛋、饲料和牛奶样品，分别用国标微生物培养法和PCR法检测沙门氏菌，阳性检出率均达到100 %，说明这两种方法检测的准确度都较高。国标微生物培养法样品中活菌的检测限为2.0CFU/25g，PCR法样品中活菌的检测限为1.0 CFU/25g，PCR法与国标微生物培养法比较具有更高灵敏度。

检测周期上，国标微生物培养法中微生物生长需要时间较长，检测周期最短也需要4天时间。PCR法只需前增菌、DNA提取和电泳分离，2天时间可以出检测结果，对于急性中毒食物的检测和新鲜即食的食品如蔬菜沙拉等可以快速检测出结果。

[1] 硕士论文《西北农林科技大学》2009年 猪肉中沙门氏菌的分离鉴定及PCR快速检测 杨永恒

[2] 《畜禽业》 2010年10期 自由市场鲜鸡蛋黄中沙门氏菌的检测韩磊 赵从凯王洪波 丁雪珍 房师梅

[3] .动物性饲料中沙门氏菌的分离鉴定与分析《中国农业科技导报》 2009年S1期

[4] 《沈阳农业大学》 2008年 影响食品安全的食源性致病菌快速检测技术与风险分析研究

[5] 《内蒙古民族大学学报(自然科学版)》 2008年03期 动物性食品中沙门氏菌检测技术研究进展