含提取大豆蛋白的载上皮细胞型微载体制备方法与工艺优化

王克益 兰州理工大学 杨晨光

（兰州理工大学）

含提取大豆蛋白的载上皮细胞型微载体制备方法与工艺优化

王克益 兰州理工大学 杨晨光

（兰州理工大学）

利用壳聚糖和大豆提取蛋白质作为主要材料，运用乳化交联法，制备粒径在17到25微米之间的微球。大豆蛋白交联后的微载体内部孔隙度为80.14%，优于作为对照组的壳聚糖/明胶微载体。通过设计一组单因素实验，制备大豆蛋白交联微载体的工艺最优条件确定如下：大豆蛋白含量为62.5%，大豆蛋白和壳聚糖的比例是3：2到2：1之间，所制备的微载体外形和性能最佳。上皮细胞在大豆蛋白交联微载体表面贴合并呈球形生长。细胞培养实验及显微镜观察表明，大豆蛋白交联的微载体具有优秀的细胞亲和力。进一步的电子显微镜观测表明，大豆蛋白交联微载体的表面极其适合细胞贴附生长。实验表明，大豆蛋白可以作为一种更新更廉价的材料，去制备微载体。

大豆蛋白；微载体；乳化交联；上皮细胞

1、简介

皮肤移植手术是一种可以替代坏死的皮肤手术[1]。殖皮手术需要培养大量的上皮细胞，以替换坏死的皮肤[2]。为了实现这一目标，在实际手术中需要制备一种与上皮细胞亲和性较好，并且可以使上皮细胞在其表面高密度培养与养分供给的微载体[3]。

壳聚糖是一种合适的生物材料，因其生物相容性和生物可降解性广泛应用于制备微球[4]。此外壳聚糖和 多糖（GAGs）具有相似的结构，而 多糖恰好是细胞外基质成分，这也是应用壳聚糖的另外一个原因[5]。

大豆蛋白在大豆中的含量高达60%到70%[6]。更重要的是，动物类蛋白可能会包含一些未知疾病源，而大豆蛋白可以恰好避免这一缺陷[7]。这意味着大豆蛋白来源广、价格低，且安全性较高，将是一种可以应用于微载体制备的新材料。在本研究中，采用壳聚糖和提取自大都的蛋白作为原材料，应用乳化交联法，制备微载体，并设计单因素实验优化工艺。

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2、实验材料和方法

2.1 实验材料

壳聚糖（分子量1.21.2×106）购买自中庆化工，明胶（分子量1.4×104）购买自光复化工。雄性Wister大鼠购买自兰州大学实验动物中心。其他化学试剂均为分析纯。

2.2 大豆蛋白提取和检测

将大豆浸泡于10倍蒸馏水中24小时，粉碎，滴加0.1mol/ mL氢氧化钠溶液，使pH保持在9，并控制温度处于25℃，过夜后放入离心机除去杂质。上清液滴加0.1mol/mL的盐酸溶液，使pH为4.5，常温下静置2h。然后离心除去上清液，蒸馏水洗涤后冷冻干燥机干燥得到提取蛋白。运用比色法检测所提取的大豆蛋白的性质与含量。

2.3 微载体制备与工艺优化

将壳聚糖和提取的蛋白溶解于1%醋酸溶液中，加入一定比例的甲苯和四氯化碳作为乳化剂，反应2小时候加入一定比例乳化剂斯班80，之后在390转/分钟的搅拌速度下持续搅拌2h，保持温度一直处于40℃，最终得到乳化液中的微载体。将整个液体抽滤，并用蒸馏水洗涤，烘干后得到含大豆蛋白的壳聚糖微载体。之后利用响应面分析软件得到工艺优化的范围值。

2.4 微载体表征

上皮细胞培养与分离方法参考Mazumder等的文章描述[8]分别将微载体与上皮细胞在细胞培养板上培养12，24，36h，观察细胞生长状况。

3、实验结果

3.1 蛋白提取

提取的大豆蛋白粉如图1-1所示，为白色至淡棕色外观不规则的白色粉末，显色法实验表明，蛋白粉末与考马斯亮蓝反应显蓝色。这些结果表明，提取所得的为大豆蛋白。光镜下微载体形态结构如图1-2所示，含大豆蛋白微载体呈粒径均一的球形。电镜下微载体特征如图1-3和1-4所示。

图1.提取自大豆的蛋白粉及微载体表征

3.2 工艺优化结果分析

响应面曲线方差分析结果如表1所示。以微载体孔隙率作为参照标准，建立模型，模型的F值是15.2，且具有显著性差异。表明模型可以说明微载体工艺优化中各参数对微载体孔隙率的影响程度。图2-1是本次实验数据的散点分布图，实验数据点集中于对角线上，这表明所建立的模型方程可以准确预测实验数据。图2-2、图2-3和图2-4显示了孔隙度受其他三个因素的影响。这三个数据的趋势表明，甲苯和四氯化碳比例对微球孔隙度的影响并不显著。影响比较显著的是壳聚糖与大豆蛋白的比例和交联剂用量。图2也表明，壳聚糖与大豆蛋白比例的最佳范围是3:2到2:1，交联剂的最佳范围从5.2到5.8毫升，甲苯与四氯化碳比例是1:3。在这些条件下,可以获得亲和性较好的、孔隙度为80.14%的大豆蛋白-壳聚糖微载体。

图2. 微载体制备工艺优化响应面分析（图2-1为散点分布图，图2-2，2-3，2-4分别为壳聚糖与大豆蛋白比例，乳化剂用量和交联剂用量响应面曲线图）

3.3 细胞培养结果

细胞培养实验结果如图3所示，大豆蛋白-壳聚糖微载体与细胞具有良好的亲和性，在12，24，36h后观察发现，细胞明显贴附微载体生长。

图3. 蛋白质-壳聚糖微载体细胞培养图（a1、b1、c1、d1分别为培养0、12、24、36h后细胞生长情况）

4、结论

实验证明，大豆蛋白-壳聚糖微载体表现出作为上皮细胞载体的极大潜力。添加了大豆蛋白的微载在粒径、孔隙度、抗压性能、密度和形状上都显示了较好的性能。这可以有效地降低生产成本。总之,大豆蛋白-壳聚糖微载体在细胞培养载体方面具有较高的意义。