采用Caco-2细胞转运模型研究胺碘酮转运机制及阿托伐他汀对其转运的影响

孔令提，刘 冬，宋春丽，朱裕林

(1.蚌埠医学院第一附属医院药剂科，安徽 蚌埠 233004； 2.重庆市南川区人民医院药剂科，重庆 408400)



采用Caco-2细胞转运模型研究胺碘酮转运机制及阿托伐他汀对其转运的影响

孔令提，刘 冬，宋春丽，朱裕林

(1.蚌埠医学院第一附属医院药剂科，安徽 蚌埠 233004； 2.重庆市南川区人民医院药剂科，重庆 408400)

目的：探讨胺碘酮的肠吸收特性，评价联合应用阿托伐他汀是否影响胺碘酮的肠吸收。方法：采用Caco-2细胞转运模型，研究胺碘酮在不同浓度下从绒毛面(apical，AP)侧到基底面(basolateral，BL)侧，以及从BL侧到AP侧2个方向的转运过程，计算表观渗透系数(apparent permeability coefficient，Papp)，考察其跨膜转运机制，同时考察维拉帕米、阿托伐他汀对其Papp值的影响。结果：不同浓度(10、20、40 μmol/L)胺碘酮的双侧转运量均随浓度增高而相应增大；不同浓度胺碘酮双向转运Papp值的差异无统计学意义(P>0.05)，且外排比率均<1.5；加入维拉帕米或阿托伐他汀对胺碘酮的Papp值无显著影响(P>0.05)；表明胺碘酮的肠吸收转运机制为被动扩散。结论：胺碘酮的肠吸收转运机制为被动扩散，联合应用阿托伐他汀时不会影响胺碘酮的肠吸收。

胺碘酮； 阿托伐他汀； Caco-2细胞模型； 表观渗透系数

胺碘酮是一种以Ⅲ类药理作用为主的心脏离子多通道阻滞剂，临床适用于房性、室性、结性及伴预激综合征(W-P-W综合征)的心律失常，是目前最常用的抗心律失常药之一[1]。阿托伐他汀除具有调节血脂作用外，还具有抑制血管内皮的炎症反应、稳定动脉粥样硬化斑块、改善血管内皮功能等作用，临床常与胺碘酮联合应用[2-5]，但两者之间是否存在相互作用尚不明确。P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是小肠上皮细胞上一种主要的转运蛋白，可将细胞内药物(底物)逆浓度转运至细胞外，从而影响口服药物的生物利用度[6]。Caco-2细胞可通过上皮样分化而形成紧密连接，其在形态学、标志酶的功能表达及渗透性等方面具有与小肠上皮细胞相同的特性，具有P-gp高表达特性，与药物的体内吸收具有良好的相关性，目前被广泛用于新药筛选及药物吸收性相互作用的研究[7-9]。本研究采用Caco-2细胞转运模型探讨胺碘酮的肠吸收特性，同时研究阿托伐他汀对胺碘酮在小肠吸收的影响，以评价两者是否存在吸收性药物相互作用。

1 材料

1.1 仪器

EVOM细胞电位仪(美国Millipore公司)；细胞培养箱(日本三洋公司)；酶标仪(美国Bio-Tek公司)；Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)。

1.2 药品与试剂

Caco-2细胞株(中科院上海细胞库，传代数为30～40代)；胎牛血清、非必需氨基酸、双抗(美国Gibco公司)；DMEM液体培养基、汉克平衡盐溶液(Hank’s balanced salt solution，HBSS)、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)(北京索莱宝公司)；6孔Transwell培养板(美国Costar公司)；胰蛋白酶、二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)、噻唑兰(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)、鼠尾胶原蛋白(美国Sigma公司)；盐酸胺碘酮标准品、黄体酮标准品(中国食品药品检定研究院提供)；乙腈、三乙胺均为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 细胞复苏

将Caco-2细胞株从液氮中取出，置于37 ℃水浴中不断振摇，待化冻完毕后移至超 净台，取出细胞悬液，加入2 ml含10%胎牛血清的DMEM培养液(下同)，离心(转速1 000 r/min，5 min)，弃上清液，加入5 ml DMEM培养液，吹散细胞，接种于细胞培养瓶中，置于含5% CO2、37 ℃培养箱(下同)中培养。

2.2 细胞培养和传代

当细胞生长至单层融合约80%时，移除培养基，用PBS润洗2次，加入胰蛋白酶消化，置于培养箱中，5 min后取出，加入DMEM培养基终止消化，用灭菌吸管吹打成细胞悬液，离心(转速1 000 r/min，5 min)，弃上清液，加入含有DMEM培养液，吹散细胞，接种于细胞培养瓶中，置于培养箱中培养。

2.3 细胞毒性实验

将对数生长期的Caco-2细胞胰酶消化后，调整细胞密度至5×105个/ml，加入96孔板，每孔接种100 μl，于培养箱中培养24 h。然后分别加入系列浓度的胺碘酮溶液100 μl(DMSO终浓度为1%)，并将含1% DMSO的HBSS溶液作为阴性对照，于培养箱中孵育3 h后，吸出上清液，加入空白HBSS 100 μl及MTT(5 mg/ml)20 μl，再培养4 h，吸出上清液，加入DMSO 100 μl，待甲瓒完全溶解后，采用酶标仪在波长570 nm处测定吸光度，从而计算细胞存活率。

2.4 Caco-2细胞转运模型的建立

取对数生长期的Caco-2细胞，胰酶消化，调整细胞密度至2×105个/ml，以3×105个/孔的密度接种于包被鼠尾胶原的六孔Transwell细胞培养板绒毛面(apical，AP)侧，基底面(basolateral，BL)侧加入培养液2.6 ml，于培养箱中培养。隔日更换培养液，待细胞分化形成致密的单细胞层后，用电阻仪测定跨膜电阻值(transepithelial electrical resistance，TEER)，取TEER>400 Ω/cm2的孔进行转运实验。

2.5 转运实验

取“2.4”项下电阻符合要求的Transwell细胞培养板，于AP侧加入37 ℃预热的pH为7.4的HBSS(下同)1.5 ml，BL侧加入HBSS 2.6 ml，于培养箱中孵育20 min，弃去双侧HBSS，重复3次。在AP或BL侧加入用HBSS配制的胺碘酮溶液(10、20和40 μmol/L)1.5或2.6 ml，BL或AP侧加入含1% DMSO的HBSS 2.6或1.5 ml，于培养箱中孵育，分别于20、40、60、80、100、120 min从BL或AP侧收集透过液样品200 μl，并补充同体积接收液，每个浓度重复3个孔。为考察P-gp抑制剂维拉帕米或阿托伐他汀对胺碘酮转运的影响，分别在AP或BL侧加入含100 μmol/L维拉帕米或50 μmol/L阿托伐他汀的胺碘酮溶液(20 μmol/L)1.5或2.6 ml，余同。

2.6 含量测定

色谱条件：色谱柱Hypersil BDS C18柱(100 mm×2.1 mm，3 μm)；柱温30 ℃；流动相2%三乙胺(用磷酸调节pH至4.8)-乙腈(V∶V=40∶60)；检测波长240 nm；流速0.8 ml/min[10-11]。精密吸取200 μl样品溶液，加入内标20 μl(黄体酮，20.0 μg/ml)，混匀后以转速12 000 r/min离心10 min，精密吸取上清液20 μl进高效液相色谱仪进行测定，用标准曲线法计算样品中胺碘酮的浓度。

2.7 数据处理

3 结果

3.1 细胞毒性实验结果

加入不同浓度胺碘酮后，经过3 h孵育，细胞的存活率见图1，可见胺碘酮浓度<200 μmol/L时无明显细胞毒性，细胞存活率达80%以上，后续转运实验时胺碘酮药物浓度分别选取10、20和40 μmol/L。

图1 不同浓度胺碘酮对Caco-2细胞生存率的影响Fig 1 Effects of different concentration of amiodarone on cell survival rate of Caco-2

3.2 胺碘酮转运实验结果

胺碘酮在不同浓度下从AP→BL及BL→AP的转运量随浓度的增高而相应增大，见图2—3。不同浓度胺碘酮的双向转运Papp值见表1，统计分析结果显示，不同浓度之间Papp值的差异无统计学意义(P>0.05)，且ER均<1.5。

图2 不同浓度胺碘酮从AP侧到BL侧的转运量Fig 2 Transport amount of different concentration of amiodarone from AP→BL

图3 不同浓度胺碘酮从BL侧到AP侧的转运量Fig 3 Transport amount of different concentration of amiodarone from BL→AP

组别Papp(×106)( x±s)AP→BLBL→APER10μmol/L胺碘酮7 03±0 536 62±0 430 9420μmol/L胺碘酮6 36±0 316 46±0 101 0240μmol/L胺碘酮7 24±0 336 50±0 100 9020μmol/L胺碘酮+维拉帕米7 06±1 086 57±0 330 9320μmol/L胺碘酮+阿托伐他汀6 85±0 486 84±0 741 00

3.3 维拉帕米和阿托伐他汀对胺碘酮转运的影响

在存在维拉帕米或阿托伐他汀条件下，胺碘酮的Papp值见表1，统计分析发现，加入维拉帕米或阿托伐他汀后，胺碘酮的Papp值与不存在维拉帕米或阿托伐他汀时的差异无统计学意义(P>0.05)，表明维拉帕米或阿托伐他汀不影响胺碘酮的转运。

4 讨论

采用Caco-2细胞转运模型研究药物的转运机制时，可根据药物的ER判断药物的转运类型，若ER>1.5，提示可能存在主动转运机制；若ER<1.5，则表明以被动扩散为主。此外，如不同浓度下测得的Papp值基本保持恒定，则可间接说明其转运不需要载体的介入，同样表明转运机制以被动扩散为主[12-15]。

本实验中，胺碘酮不同浓度之间Papp值的差异无统计学意义，各组的ER均<1.5，且P-gp抑制剂维拉帕米对其Papp值无显著影响，表明胺碘酮在小肠上皮细胞上的转运机制为被动扩散。阿托伐他汀与胺碘酮合用时，胺碘酮的Papp值与单用胺碘酮时的Papp值比较，差异无统计学意义，表明阿托伐他汀不影响胺碘酮的吸收。

综上所述，胺碘酮在Caco-2单层细胞模型中的转运主要通过被动扩散形式进行，临床联合应用胺碘酮与阿托伐他汀时无需考虑肠吸收方面的相互作用。

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Study on Transport Mechanism of Amiodarone and Effect of Atorvastatin on Transport of Amiodarone by Caco-2 Cell Monolayer ModelΔ

KONG Lingti1, LIU Dong2, SONG Chunli1, ZHU Yulin1

(1.Dept.of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College,Anhui Bengbu 233004, China; 2.Dept.of Pharmacy, Chongqing Nanchuan District People’s Hospital, Chongqing 408400, China)

OBJECTIVE：To probe into the intestinal absorption characteristics of amiodarone, and to evaluate the effects of combination of atorvastatin on intestinal absorption of amiodarone. METHODS: The apparent permeability coefficients(Papp) of amiodarone in both the apical-to-basolateral(AP→BL) and the basolateral-to-apical(BL→AP) direction were studied by using the Caco-2 cell monolayer model, the transport mechanism of membrane-disrupting were also evaluated. And the effects of verapamil and atorvastatin on the Papp value was determined. RESULTS: The bilateral transfer capacity of amiodarone increased with the ascent of concentration(10 μmol/L, 20 μmol/L, 40 μmol/L). There was no significant difference in Papp values of different concentrations(P>0.05), and the outside ratio were all less than 1.5. There was no obvious effects on Papp values with verapamil or atorvastatin(P>0.05), which indicated that the transport mechanism of intestinal absorption of amiodarone was passive diffusion. CONCLUSIONS: The passive diffusion is the main transport mechanism of intestinal absorption of amiodarone, and combination of atorvastatin does not affect the intestinal absorption of amiodarone.

Amiodarone; Atorvastatin; Caco-2 cell monolayer; Apparent permeability coefficient

蚌埠医学院自然科学基金重点项目(No.BYKY1425ZD)

R96

A

1672-2124(2016)11-1472-03

2016-07-26)

*主管药师，博士。研究方向：临床药理学及临床药学。E-mail：konglingti@163.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2016.11.009