从网络药理学角度探讨骨关节炎方证对应研究的思路与方法

郑春松，严培晶，付长龙，叶蕻芝，刘献祥

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州350122；

2.福建生物工程职业技术学院，福建福州350002；

3.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建福州350122）

·理论探讨·

从网络药理学角度探讨骨关节炎方证对应研究的思路与方法

郑春松1，严培晶2，付长龙3，叶蕻芝1，刘献祥1

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州350122；

2.福建生物工程职业技术学院，福建福州350002；

3.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建福州350122）

目的建立骨关节炎（OA）方证对应的网络药理学研究策略。方法通过基因芯片、代谢组学等得到临床骨关节炎气滞血瘀证、寒湿痹阻证、肝肾亏虚证、气血虚弱证患者与无上述证候、无慢性骨关节炎的关节外伤患者比较的差异基因和代谢物，构建和分析证候分型的分子网络；查阅膝骨关节炎中医诊疗专家共识（2015年版），运用计算模拟与数据建模平台，构建和分析证候分型代表方与骨关节炎靶基因、靶蛋白、生物通路的作用网络，找到其关键化合物和靶标，并进行实验验证。结果形成了OA证候分型的分子网络研究思路，诠释证候分型的实质；形成了证候分型代表方的分子网络研究思路，诠释各代表方在治疗骨关节炎的药理途径异同点；建立了网络中关键化合物和靶标的验证方法，诠释各代表方对相应证候分型治疗中的优势。结论骨关节炎方证对应的网络药理学新方法，将为骨关节炎的个体化诊疗提供帮助。

骨关节炎；方证对应；网络药理学；中医药疗法；个体化诊疗

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种以关节软骨变性、破坏及骨质增生为主要特征的慢性常见病，是中医骨伤科治疗的优势病种［1-2］。2015年中国中医药研究促进会骨伤专业委员会以及中国中西医结合学会骨伤科专业委员会关节工作委员会形成了膝骨关节炎中医诊疗专家共识，认为OA分为气滞血瘀证、寒湿痹阻证、肝肾亏虚证和气血虚弱证，分别可以用血府逐瘀汤、蠲痹汤、左归丸和八珍汤等加减治疗［2］。然而，这种中医临床的辨证用药及各种治疗方法，以经验为基础，缺乏现代的语言，难以被人们普遍理解和接受，阻碍中医药成为OA主流疗法的可能［3］。网络药理学是借助“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络平台，从系统的角度探索药物对疾病网络的干预与影响，具有整体性和系统性特点，为中医药复杂体系的现代医学诠释提供新途径［4-5］。因此，在膝骨关节炎中医诊疗专家共识基础上，本文首次提出了从网络药理学角度开展OA方证对应研究的的思路与方法。

1 理论基础

方证对应，源于东汉医家张仲景的《伤寒论》，是探讨方药与病证之间一一对应关系的学说，是作为中医辨证论治中的一个重要概念［6-7］。分析不同证下的网络药理学特征有助于深入研究中医药［8］，阐明方药的药效物质基础及机制，筛选出方药的最佳适应人群，为开展OA的精准医疗提供帮助。

OA属于中医的“痹症”范畴［1，9］，《素问·逆论调篇》曰：“骨痹，是人当挛节也。”《中藏经》曰：“骨痹者，乃食欲不节，伤于肾也。肾气内消，则不能关禁……。”《素问·长刺节论篇》曰：“病在骨，骨重不可举，骨髓酸痛，寒气至，名曰骨痹。”《素问·脉要精微论》曰：“膝者，筋之府，屈伸不能，行则偻俯，筋将惫矣。”《素问·六节脏象论》曰：“肝者，其充在筋。”《素问·痹论》曰：“风寒湿三气杂至，合而为痹也。其风气胜者为行痹；寒气胜者为着痹也。……痹在于骨则重，在于脉则血凝而不流，在于筋则屈不伸，在于肉则不仁，在于皮则寒。”《诸病源候论·风病诸候》曰：“亦有血气虚，受风邪而得之者”。《景岳全书》曰：“风痹之证，大抵因虚者多，惟气血不充，故风寒得以入之，惟阴邪留滞，故经脉为之不利。”又曰：“盖痹者闭也，以血气为邪所闭，不得通行而病也。”《卫生宝鉴》曰：“老年腰膝久痛，牵引少腹两足，不堪步履，奇经之脉，隶于肝肾为多。”因此，OA多为“本虚标实”“本痿标痹”之证，临床上将其分为气滞血瘀证、寒湿痹阻证、肝肾亏虚证和气血虚弱证，应采取不同的方药进行治疗。

网络药理学是由2007年由University of Dundee的Hopkins AL首次提出［10］，是一种基于网络数据库、计算模拟和各组学技术等平台的新药发现、药效物质基础及作用机制研究方法，系统地揭示了药物对疾病的干预与影响，具有整体性与动态性的特点，与中医理论的系统观和整体论思想不谋而合［11］。中药复方是中医预防和治疗疾病的主要形式，其物质基础为四气五味。一般来说，一种药物只有一种药性，但可以有一种或多种气味。气味相近，则功效相近。气味相异，则功效不同。功效不同，则作用机体的靶标也不同，即中药复方具有多靶点的作用特征［12］。而且，证候是有许多因素组成的复杂系统，难以用单一的生物学指标来表达，其与生物网络的调节机制具有关联性［13-14］。因此，借助网络药理学，可以从分子层面观察方与证的内在整体性对应情况，有助于证候客观化和个体化诊疗。

2 实验设计

2.1 选择与证对应的方药

2.1.1 OA气滞血瘀证与血府逐瘀汤OA气滞血瘀证病人的典型临床表现：①关节疼痛如刺，休息后痛反甚；②面色黧黑；③舌质紫暗，或有瘀斑，脉沉涩。治法是活血化瘀、通络止痛，方剂用清代医家王清任著作《医林改错》中的血府逐瘀汤［2］。

2.1.2 OA寒湿痹阻证与蠲痹汤OA寒湿痹阻证病人的典型临床表现：①关节疼痛重着，遇冷加剧，得温则减；②腰身重痛；③舌质淡，苔白腻，脉沉。治法是温经散寒、养血通脉，方剂用清代医家程钟龄著作《医学心悟》中的蠲痹汤［2］。

2.1.3 OA肝肾亏虚证与左归丸OA肝肾亏虚证病人的典型临床表现：①关节隐隐作痛；②腰膝酸软无力，酸困疼痛，遇劳更甚；③舌质红，少苔，脉沉细无力。治法是滋补肝肾，方剂用明代医家张景岳著作《景岳全书》中的左归丸［2］。

2.1.4 OA气血虚弱证与八珍汤OA气血虚弱证病人的典型临床表现：①关节酸痛不适；②少寐多梦，自汗盗汗，头晕目眩，心悸气短，面上少华；③舌淡，苔薄白，脉细弱。治法是补气养血，方剂用元朝医家朱震亨著作《丹溪心法》中的八珍汤［2］。

2.2 证候分型的OA疾病网络构建与分析OA组的血样、关节液、软骨组织、滑膜组织分别取自行膝关节置换术的气滞血瘀证、寒湿痹阻证、肝肾亏虚证和气血虚弱证OA病人，正常组的血样、关节液、软骨组织、滑膜组织取自无慢性关节炎、无上述证候分型健康人群中仅因关节外伤引起的病人［15-16］。通过基因芯片技术、蛋白组学和代谢组学技术等，与正常组比较，得到OA组病人中软骨组织中软骨细胞、滑膜组织中滑膜细胞的差异基因和蛋白，以及关节液、血样中差异代谢物，综合Biological General Repository for Interaction Datasets（BioGRID，http：// www.thebiogrid.org）、Database of Interacting Proteins（DIP，http：//dip.doe-mbi.ucla.edu/dip/Main.cgi）和STRING 10.0（http：//string-db.org/）等数据库信息及来自文本挖掘的数据［17-18］，在Cytoscape 2.8.3软件平台上［19］，直观显示OA组证候分型相关的蛋白质-蛋白质相互作用网络。通过ClueGO、KEGG和REACTOME分析［18，20］，预测其对应的作用通路，建立蛋白质-通路网络。利用Cytoscape 2.8.3软件中Plugins面板下的Network analysis，比较OA证候分型的差异性。

2.3 OA“方-证”关联网络构建与分析以血府逐瘀汤、蠲痹汤、左归丸和八珍汤为研究对象，利用“PubChem”“中药原植物化学成分手册”“中国知网”等检索上述方药的各组成中药成分，通过Discovery Studio计算模拟与数据建模平台［21］，构建上述方药的分子数据库。以2.2项下的蛋白为靶标，若其有晶体结构，从pdb数据库（http：//www.rcsb.org/），采用分子对接技术［21］，研究方药分子数据库中化合物与靶标的作用；若其无晶体结构，采用药效团搜索或机器学习方法［22-23］，辨识出作用于靶标的化合物。将化合物、靶标和通路视为节点，相互作用视为边，在Cytoscape 2.8.3软件平台上［19］，构建证候分型对应方药的化合物-靶标-通路作用网络。利用Cytoscape 2.8.3软件中的Network analysis，分析不同方药对OA证候分型病人所起到的作用，找到不同方药作用的关键靶标和化合物。

2.4 实验验证

2.4.1 关键靶标的验证

2.4.1.1 体内实验以改良Hulth造模法复制大鼠膝骨关节炎为模型［24］，设立血府逐瘀汤组、蠲痹汤组、左归丸组、八珍汤组和和生理盐水组，按照药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算［25］，分别给予相应的药物干预4周后，用戊巴比妥钠麻醉下腹主动脉采血［26］，并取膝关节的关节液、软骨组织和滑膜组织［27-28］，借助免疫组化、Elisa和Western blot方法，分析各方药治疗后对应关键靶标蛋白表达的变化，证实其作用的关键靶标。

2.4.1.2 体外实验利用2月龄的雄性大鼠，制备大鼠血府逐瘀汤组、蠲痹汤组、左归丸组、八珍汤组和生理盐水组的含药血清。以白细胞介素1β诱导大鼠软骨细胞建立体外模型，实验分为血府逐瘀汤组、蠲痹汤组、左归丸组、八珍汤组和和生理盐水组，分别给予含10%血府逐瘀汤血清、蠲痹汤血清、左归丸血清、八珍汤血清、生理盐水组血清的DMEM培养基培养72 h后，收集其培养液和软骨细胞［29］。借助免疫组化、Elisa和Western blot方法，分析各方药含药血清干预退变软骨细胞后对应关键靶标蛋白表达的变化，证实其作用的关键靶标。

2.4.2 关键化合物的验证在关键靶标验证的基础上，采取固定化药物靶标方法和分子烙印方法［31-32］，辨识方药的有效成分，验证预测的关键活性化合物。固定化药物靶标方法，即将已经验证的靶标固定在球状载体上，制备亲和色谱，利用靶标对血府逐瘀汤、蠲痹汤、左归丸和八珍汤中化合物亲和力的差异，运用色谱-质谱联用技术，通过质谱的选择离子流图来分析数据，根据化合物在亲和色谱柱保留时间的长短，确定化合物对靶标的结合能力，从方药中筛选和鉴定出活性成分。若难以得到药物靶标，我们可以通过这个靶标的已知活性配体制备这个靶标的模拟物进行筛选，即分子烙印方法。首先，选择一个活性分子作为模板分子，然后，选择合适的功能高分子与之聚合，最后从聚合物中除去模板分子即得到靶标的模拟物，用聚合物作为液相色谱的固定相直接用于方药血府逐瘀汤、蠲痹汤、左归丸和八珍汤活性成分的筛选。

3 结语

不同方剂对机体疾病状态的改善作用会因证候分型不同而具有差异性，通过网络药理学，可以更好揭示疾病与证候、证候与方剂之间的关系。本文提出了OA方证对应研究新思路，即以OA的常见证候分型气滞血瘀证、寒湿痹阻证、肝肾亏虚证、气血虚弱证为切入点，以各分型对应的代表方血府逐瘀汤、蠲痹汤、左归丸和八珍汤为示范药物，采用网络药理学方法，观察OA各证候分型的差异蛋白，以及对应方药作用的靶标。结合实验验证，从微观角度将方药和证候有机地对应起来，揭示不同方药对OA各证候分型网络的作用情况及方药中组分间的相互作用规律，从而阐释OA方证对应模式的科学内涵，使得OA的证候分型研究更具可操作性，促进OA中医精准治疗的发展，对中医药现代化研究方法体系和中药新药的研发都具有重要的实际意义。

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R275.9

：A

：1000-338X（2016）06-0049-03

2019-09-15

福建省自然科学基金项目（2015J01338）；福建省中青年教师教育科研项目（JA14152）

郑春松（1982—），男，助理研究员，医学博士，主要从事中西医结合骨伤科研究。

刘献祥（1963—），男，教授，博士生导师。

E-mail：liuxianxiang@163.com