具有降糖作用的鼠李糖乳杆菌生物学特性研究

陈 佩,党 辉,王 伟,陈 卫

(1.陕西广播电视大学，陕西西安 710119;2.陕西理工学院,生物科学与工程学院，陕西汉中 723001;3.江南大学 食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡 214122;4.陕西师范大学 食品工程与营养科学学院,陕西西安 710119)



具有降糖作用的鼠李糖乳杆菌生物学特性研究

陈 佩1,2,党 辉3,4,王 伟1,陈 卫3,*

(1.陕西广播电视大学，陕西西安 710119;2.陕西理工学院,生物科学与工程学院，陕西汉中 723001;3.江南大学 食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡 214122;4.陕西师范大学 食品工程与营养科学学院,陕西西安 710119)

本研究旨在评价一株具有降糖作用的鼠李糖乳杆菌的生物学特性。结果表明,该菌株生长较快,2 h进入生长对数期,14 h后进入稳定期,最适生长pH为5～7,最适生长温度为37 ℃,最适接种量为1%～2%(V/V)。此外,该菌株在强酸条件下可以生长,对人工胃肠液都具有很好的耐受性,耐受胆盐的延迟时间为0.86 h,在NaCl浓度为9%(W/V)的培养条件下仍可以存活。更为重要的是,这株菌对Caco-2细胞具有较强的粘附能力。综上所述:该鼠李糖乳杆菌菌株可作为一株具有潜在降糖作用的发酵菌株,用以开发具有降糖作用的新型发酵产品。

降糖,鼠李糖乳杆菌,生物学特性

糖尿病(Diabetes Mellitus)是由多种病因引起的代谢性疾病[1]。我国糖尿病患者人数在过去30年中快速增长了近10倍[2]。目前我国糖尿病人数已超过1亿,成为全球糖尿病人数第一大国[3]。因此,对糖尿病的预防和治疗有非常迫切的需求。

近年来,乳酸菌被证实具有预防和治疗糖尿病的作用。1997年开始Matsuzaki[4]等人发现干酪乳杆菌可降低NIDDM KK-Ay小鼠的血糖,并改善机体免疫。Ma[5]等研究表明VSL#3(双歧杆菌,唾液链球菌,乳酸杆菌)可预防自发性糖尿病的发生。Laitinen[6]等发现鼠李糖乳杆菌和双歧杆菌可以很好的控制孕妇生产前后的血糖水平,使其具有良好的葡萄糖耐受性,并可提高胰岛素敏感性。Yun[7]等研究表明加氏乳杆菌可降低血糖并改善db/db小鼠糖尿病症状。Andreasen[8]发现嗜酸乳杆菌可以改善正常志愿者、糖耐量受损病人和Ⅱ型糖尿病患者的胰岛素敏感性,并且植物乳杆菌能够降低糖尿病小鼠血糖。Naito[9]等表明乳酸杆菌代田株能够改善糖尿病小鼠的糖耐量。Moroti[10]发现嗜酸乳杆菌和双歧杆菌显著降低糖尿病老年患者血糖水平。Ejtahed[11]研究表明嗜酸乳杆菌和双歧杆菌改善Ⅱ型糖尿病人空腹血糖并具有抗氧化作用。因此,筛选具有降糖作用的乳酸菌仍然是一个重要的课题。本实验在前期已筛选并证明鼠李糖乳杆菌具有降糖作用[12],在此研究基础上,本文主要研究这株鼠李糖乳杆菌的生物学特性,以期为后续的生产应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鼠李糖乳酸杆菌 江南大学食品生物与技术中心菌株保藏库;胃蛋白酶(1∶10000)、胰蛋白酶(1∶250)、巯基乙酸钠 美国sigma公司;人结肠癌腺细胞系Caco-2细胞株 上海生命科学研究院细胞资源中心;DMEM高糖培养基、0.25%胰酶、胎牛血清、双抗(青、链霉素) 美国Gibico公司。

SW-CJ-1CV超净台 苏州安泰空气技术有限公司;UV-2100紫外可见分光光度计 尤尼科上海有限公司;5415R冷冻离心机 德国Eppendorf公司;CX41-12C02倒置显微镜 日本Olympus公司;细胞培养瓶 美国Corning公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鼠李糖乳杆菌的制备 将冻存于-80 ℃的鼠李糖乳酸杆菌接入MRS液体培养基中,37 ℃培养18 h,连续活化三代后用于后续实验。

1.2.2 鼠李糖乳杆菌在人工模拟胃肠液中的生长测定 人工模拟胃肠液需新鲜配制。用PBS(pH3.0)配制浓度为3 g/L的胃蛋白酶,过0.22 μm滤膜后制备成所需模拟胃液。用PBS(pH8.0)配置浓度为1 g/L的胰蛋白酶,过0.22 μm滤膜后制备成模拟肠液[13]。

乳酸菌以生理盐水重悬,并将其菌液密度在模拟胃液(pH3.0)中调节至 1×109CFU/mL,充分混匀,在37 ℃培养1、2和3 h后检测活菌数。3 h后,取模拟胃液(pH3.0)中的培养液1 mL加入至9 mL的模拟肠液(pH8.0)中,充分混匀,在37 ℃培养2、4和8 h后检测活菌数[14]。用MRS固体培养基37 ℃培养48 h,乳酸菌的存活率用以下公式计算:

存活率(%)=log cfu N1/log cfu N0×100

N1=经过模拟胃肠液处理之后的乳酸菌活菌数,N0=未处理前乳酸菌的活菌数[15]。

1.2.3 鼠李糖乳杆菌对胆盐的耐受能力 取对数生长期的鼠李糖乳杆菌,以2%的接种量分别接种于含有或不含0.3%胆盐的MRS-THIO(MRS含有0.2%的巯基乙酸钠)培养中,充分混合均匀,在37 ℃下培养。记录培养基吸光值到达0.3个单位时各组所需的时间,不加胆盐与加了胆盐两组的时间差即为鼠李糖乳杆菌在胆盐中生长的延迟时间(LT),延迟时间的长短,反映了乳酸菌对胆盐的耐受能力。时间越短,说明耐受胆盐的能力越强,反之则耐受胆盐的能力越弱[16]。

1.2.4 鼠李糖乳杆菌对Caco-2细胞的粘附能力测定 以含有20%胎牛血清,1% L-谷氨酰胺,1%非必需氨基酸和1%双抗的高糖DMEM完全培养基培养Caco-2细胞,37 ℃,5% CO2的培养箱中进行培养,每天换液,待细胞增殖融合率达到80%左右时,胰酶消化后按照1∶3进行传代。取对数生长期的细胞进行下步实验。

Caco-2细胞以4×104cell/孔接种于6孔板中,37 ℃培养24 h。将培养至对数期的鼠李糖乳杆菌离心后用PBS(pH7.2)冲洗3次,重悬于高糖DMEM完全培养基中,调整菌液浓度为1×109CFU/mL,加入到已生长好的Caco-2细胞单层中,37 ℃培养2 h。再以PBS冲洗细胞单层3次,后用甲醇固定30 min,再进行革兰氏染色。随机找20个视野数100个细胞,以平均每个细胞上粘附的鼠李糖乳杆菌数来评价其粘附能力[17]。

1.2.5 鼠李糖乳杆菌对NaCl的耐受能力测定 取对数生长期的鼠李糖乳杆菌,以2%接种量分别接入到NaCl质量分数为0%、2%、4%、6%、7%、8%、9%(w/v)的MRS液体培养基中,充分混合均匀,在37 ℃下培养18 h后测定其菌液OD600 nm值[18]。

1.2.6 鼠李糖乳杆菌的最适接种量测定 取对数生长期的鼠李糖乳杆菌,按接种量0.5%、1%、1.5%、2%、5%和10%(v/v)分别加入到MRS液体培养基中,充分混合均匀,在37 ℃下培养18 h后测定其菌液OD600 nm值[19]。

1.2.7 鼠李糖乳杆菌的最适pH测定 以HCl(1 mol/L)调节MRS液体培养基pH分别为2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、6.5和7.0,取对数生长期的鼠李糖乳杆菌,以2%的接种量接种,充分混合均匀,在37 ℃下培养18 h后测定其菌液OD600 nm值[19]。

1.2.8 鼠李糖乳杆菌的最适生长温度测定 取对数生长期的鼠李糖乳杆菌,按接种量2%接种后,分别在22、26、34、37、42 ℃下培养18 h后测定其菌液OD600 nm值[19]。

1.2.9 鼠李糖乳杆菌的生长曲线测定 取对数生长期的鼠李糖乳杆菌,以2%的接种量接入到MRS液体培养基中,在37 ℃下培养24 h,每隔2 h取样,测定其菌液OD600 nm值[19]。

2 结果与讨论

2.1 鼠李糖乳杆菌在人工模拟胃液(pH3.0)中的存活率

人体胃液的pH(2.5～3.5)一般维持较低水平,是阻止细菌进入肠道的天然屏障,一般食物在胃中消化停留时间为2～4 h[13]。乳酸菌要进入肠道发挥其益生作用,首先应该具有耐受胃液的能力。图1表明,鼠李糖乳杆菌在人工模拟胃液(pH3.0)中可存活3 h,并且存活率大于80%。Matsumoto[20]等研究发现菌株的耐酸能力大小,与菌株的H+-ATP酶活性有关。因此,本实验中的鼠李糖乳杆菌具有较好的耐酸能力,可能与其H+-ATP酶活性有关。

图1 鼠李糖乳杆菌在模拟胃液(pH3.0)中的存活率Fig.1 Survival rate of L. rhamnosus to simulated gastric juice(pH3.0)

2.2 鼠李糖乳杆菌在人工模拟肠液(pH8.0)中的存活率

如图2所示,鼠李糖乳杆菌在模拟肠液(pH8.0)中可存活8 h,且存活率可达到90%以上,这与Haarman[21]等研究结果一致,乳杆菌在肠液中的存活率较高,故其是人体肠道中的主要益生菌群。

图2 鼠李糖乳杆菌在模拟肠液(pH8.0)中的存活率Fig.2 Survival rate of L. rhamnosus to simulated intestinal juice(pH8.0)

2.3 鼠李糖乳杆菌对胆盐的耐受性

人体肠道中胆盐的含量大约为0.3%,乳酸菌经摄入后,先后经过人体的胃和小肠,最终才能定殖。目前,菌株对于胆盐的耐受能力已经成为评价菌株是否能够在肠道中生存与定殖的一个重要条件[22]。表1中所示,本实验中的鼠李糖乳杆菌对于胆盐的延迟时间为0.86 h,说明此菌株对胆盐具有很好的耐受性。

表1 胆盐对鼠李糖乳杆菌生长的作用Table 1 Effect of bile salts on the growth rate of L. rhamnosus

2.4 鼠李糖乳杆菌对Caco-2细胞的粘附能力

为了调节肠道菌群,发挥益生作用,乳酸菌必须能够在胃肠道中良好定殖,粘附是乳酸菌与宿主细胞相互作用的第一步[23]。因此,菌株的粘附能力是评价其是否能够成为优良菌株的一个必要条件。Caco-2细胞是一种人克隆结肠腺癌细胞,结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞,可以较好的模拟人体肠道中的环境。

图3中可看出,鼠李糖乳杆菌菌体形态完整,并且对Caco-2细胞具有一定的粘附能力,依据实验统计结果表明粘附率为10 个/cell。由此推测,鼠李糖乳杆菌在人体肠道中应具有较好的定殖能力。李清[24]等研究表明菌株对Caco-2细胞的粘附能力与其表面蛋白类物质及其他大分子物质有关。

图3 鼠李糖乳杆菌对Caco-2细胞的粘附形态(×400)Fig.3 The morphology of adherent of L. rhamnosus to Caco-2 cells(×400)

2.5 鼠李糖乳杆菌对NaCl的耐受性

鼠李糖乳杆菌对NaCl具有较强的耐受能力,其在NaCl浓度为9%时仍然可以生长。如图4所示,当NaCl浓度超过4%后,菌株的生长能力急剧下降。

图4 不同NaCl浓度下鼠李糖乳杆菌生长情况Fig.4 The growths of L. rhamnosus in different levels of sodium chloride

2.6 鼠李糖乳杆菌在不同接种量下的生长情况

图5 不同接种量对鼠李糖乳杆菌生长的影响Fig.5 The growth effect of the L. rhamnosus in different inoculums densities

不同接种量下菌株的生长情况见图5。随着接种量的增加鼠李糖乳杆菌的OD值呈上升趋势,相应的pH呈下降趋势。综合考虑,菌株培养时可选取的最适接种量在1%～2%之间,培养液的pH在4.4左右。

2.7 鼠李糖乳杆菌在不同pH下的生长情况

鼠李糖乳杆菌在不同pH中的生长情况见图6,结果表明菌株生长的最适pH为5～7。该菌株在pH2的低酸环境中依然可以生长,说明其有较好的耐酸性,这与本文之前耐受人工胃液的结果一致。

图6 不同pH对鼠李糖乳杆菌生长的影响Fig.6 The growth effect of the L. rhamnosus in different pH

2.8 鼠李糖乳杆菌在不同温度下的生长情况

鼠李糖乳杆菌在不同温度中的生长情况见图7,结果表明菌株在温度为22～42 ℃范围内均可以生长,pH随着菌液OD值的变化而有相应的变化。综合考虑,此菌株的最适培养温度为37 ℃,培养液的pH在4.4左右。

图7 不同温度对鼠李糖乳杆菌生长的影响Fig.7 The growth effect of the L. rhamnosus in different temperature

2.9 鼠李糖乳杆菌的生长曲线

鼠李糖乳杆菌的生长曲线见图8,结果表明此菌株的生长周期较短,培养2 h后即进入对数生长期,14 h后进入稳定期。

图8 菌液OD值随培养时间变化曲线Fig.8 The changes of bacteria liquid OD value with culture time

3 结论

目前,全球的糖尿病发病率和患者总数都呈逐年增加的趋势,而传统降糖药物的使用会引发一系列的副作用,因此人们逐渐将目光投入到更安全的天然食品,以寻求理想的降糖保健食品。国内外的研究表明乳酸菌通过调节宿主肠道菌群达到降糖的作用,筛选具有降糖作用的乳酸菌是一个非常有意义的课题。本研究对一株具有潜在的降糖作用的鼠李糖乳杆菌生物学特性进行了研究。结果表明该菌株在强酸条件下可以生长,对人工胃肠液都具有很好的耐受性,耐受胆盐的延迟时间为0.86 h,在高浓度的NaCl(9%,W/V)溶液中仍可以存活,并且该菌株对Caco-2细胞具有较强的粘附能力。故该菌株可以作为潜在降糖的益生菌,未来可进一步研究开发出具有降糖作用的新型发酵产品。

[1]Zimmet P,Alberti K G,Shaw J. Global and societal implications of the diabetes epidemic[J]. Nature,2001,414(6865):782-787.

[2]Yang W Y,Lu J M,Weng J P,et al. Prevalence of Diabetes among Men and Women in China[J]. The New England Journal of Medicine,2010,362(12):1090-1101.

[3]毕艳.中国糖尿病慢性并发症的流行病学研究现况[J].中国糖尿病杂志,2015,7(8):467-469.

[4]Matsuzaki T,Yamazaki R,Hashimoto S,et al. Antidiabetic effects of an oral administration of Lactobacillus casei in a non-insulin-dependent diabetes mellitus(NIDDM)model using KK-Ay mice[J]. Endocrine journal,1997,44(3):357-365.

[5]Ma X,Hua J,Li Z. Probiotics improve high fat diet-induced hepatic steatosis and insulin resistance by increasing hepatic NKT cells[J]. Journal of hepatology,2008,49(5):821-830.

[6]Kirsi L,Tuija P,Erika I. Probiotics and dietary counselling contribute to glucose regulation during and after pregnancy:a randomised controlled trial[J]. British Journal of Nutrition,2009,101(11):1679-1687.

[7]Yun S I,Park H O,Kang J H. Effect of Lactobacillus gasseri BNR17 on blood glucose levels and body weight in a mouse model of type 2 diabetes[J]. Journal of Applied Microbiology,2009,107(5):1681-1686.

[8]Sofie A A,Nadja L,Theis P S,et al. Effects of Lactobacillus acidophilus NCFM on insulin sensitivity and the systemic inflammatory response in human subjects[J]. British Journal of Nutrition,2010,104(12):1831-1838.

[9]Naito E,Yoshida Y,Makino K,et al. Beneficial effect of oral administration of Lactobacillus casei strain Shirota on insulin resistance in diet-induced obesity mice[J]. J Appl Microbiol,2011,110(3):650-657.

[10]Moroti C,Magri L F S,Costa M D R,et al. Effect of the consumption of a new symbiotic shake on glycemia and cholesterol levels in elderly people with type 2 diabetes mellitus[J]. Lipids in Health & Disease,2012,11(4):29.

[11]Ejtahed H S,Mohtadi-Nia J,Homayouni-Rad A,et al.Probiotic yogurt improves antioxidant status in type 2 diabetic patients[J]. Nutrition,2012,28(5):539-543.

[12]陈佩,党辉,张秋香,等.鼠李糖乳酸杆菌对高脂饮食和链脲霉素诱发的Ⅱ型糖尿病小鼠的降糖作用[J].食品工业科技,2013,34(24):351-354.

[13]Yang H,Adams M C.Invitroassessment of the upper gastrointestinal tolerance of potential probiotic dairy propionibacteria[J]. International Journal of Food Microbiology,2004,91(3):253-260.

[14]Guo Z,Wang J C,Yuan L Y,et al.Invitrocomparison of probiotic properties of Lactobacillus casei Zhang,a potential new probiotic,with selected probiotic strains[J]. LWT-Food Science and Technology 2009,42(10):1640-1646.

[15]Bao Y,Zhang Y,Zhang Y,et al. Screening of potential probiotic properties of Lactobacillus fermentum isolated from traditional dairy products[J]. Food Control 2010,21(5):695-701.

[16]Usman,Hosono A. Bile Tolerance,Taurocholate Deconjugation,and Binding of Cholesterol by Lactobacillus gasseri Strains[J]. Journal of Dairy Science,1999,82(2):243-248.

[17]Irene B,Tomás G C,Blanca H L,et al. Effect of flavan-3-ols on the adhesion of potential probiotic lactobacilli to intestinal cells[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry,2012,60(36):9082-9090.

[18]张庆,唐永洪,林凯,等.高盐稀态发酵酱油酱醅中耐盐乳酸菌的分离与鉴定[J].中国调味品,2014(9):11-15.

[19]陈晓华,肖苇苇,田丰伟,等.具有拮抗幽门螺杆菌作用的植物乳杆菌特性研究[J].食品工业科技,2012(02):195-198.

[20]Mitsuharu M,Hifumi O,Yoshimi B. H+-ATPase activity in Bifidobacterium with special reference to acid tolerance[J]. International Journal of Food Microbiology,2004,93(1):109-113.

[21]Haarman M,Knol J. Quantitative real-time PCR analysis of fecal Lactobacillus species in infants receiving a prebiotic infant formula[J]. Applied and Environmental Microbiology,2006,72(4):2359-2365.

[22]Succi M,Tremonte P,Reale A,et al. Bile salt and acid tolerance of Lactobacillus rhamnosus strains isolated from Parmigiano Reggiano cheese[J]. FEMS microbiology letters,2005,244(1):129-137.

[23]Blum S,Reniero R,Schiffrin E J,et al. Adhesion studies for probiotics:need for validation and refinement[J]. Trends Food Sci Tech,1999,10(12):405-410.

[24]李清,刘小莉,王英,等.植物乳杆菌表面性质及对Caco-2细胞的黏附[J].食品科学,2015,36(9):97-101.

Biological characteristics ofLactobacillusrhamnosuswith antidiabetic activity

CHEN Pei1,2,DANG Hui3,4,WANG Wei1,CHEN Wei3,*

(1.Shaanxi Radio & TV University,Xi’an 710119,China;2.Shaanxi University of Technology,School of Biological Science and Engineering,Hanzhong 723001,China;3.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;4. College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi’an 710119,China)

ToinvestigatethebiologicalcharacteristicsofaLactobacillus rhamnosusstrainwithanti-diabeticactivity.TheresultsshowedthatthelogarithmictimeofthisLactobacillus rhamnosusstrainwasfrom2thhourto14thhour.TheoptimumpHandtemperatureforitsgrowthwas5～7and37 ℃,respectively,anditsoptimuminoculatedconcentrationwas1%～2%(V/V).Besides,thisstraincouldgrowunderstronglyacidicconditions,andsurviveinthesimulatedgastro-intestinaljuice.Thebiletoleranceofthisstrainintheformoflagtimewas0.86h,anditcouldgrowunder9%NaCl(W/V)conditions.Moreimportantly,itpossessedstrongadhesivepropertiestoCaco-2cells.Insummary,thisLactobacillus rhamnosusstrainwithantidiabeticactivitycouldbeappliedtodevelopnovelfermentedfoodproductswithhypoglycemiceffect.

antidiabetic;Lactobacillus rhamnosus;biologicalcharacteristics

2016-01-14

陈佩(1983-)，女，博士，讲师，研究方向：食品微生物,E-mail:angelchen186@163.com。

*通讯作者:陈卫(1966-)，男，博士，教授，研究方向：功能性益生乳酸茵的开发及其在乳制品中的应用，E-mail:chenwei66@jiangnan.edu.cn。

陕西省农业科技创新与攻关项目(2015NY025);陕西广播电视大学重点课题(15D-08-A02)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)21-0162-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.023