基于凝胶型阴离子交换树脂的齐墩果酸纯化工艺

杨裕启，刘远河，王 灿，张南海，黄齐红，黎云磊，吴一微

(1.湖北师范大学，湖北 黄石 435002；2.湖北理工学院，湖北 黄石 435001)



基于凝胶型阴离子交换树脂的齐墩果酸纯化工艺

杨裕启1，2，刘远河2，王 灿2，张南海2，黄齐红2，黎云磊2，吴一微1

(1.湖北师范大学，湖北 黄石 435002；2.湖北理工学院，湖北 黄石 435001)

采用凝胶型阴离子交换树脂纯化从女贞子果皮中提取的齐墩果酸粗品，通过单因素实验、正交实验优化了纯化工艺条件。确定最优纯化工艺条件为：树脂粒度100目、吸附和洗脱温度30 ℃、洗脱液乙醇体积分数80%，在此工艺条件下，所得齐墩果酸含量大于98%、回收率大于96%。

齐墩果酸；凝胶型阴离子交换树脂；纯化

齐墩果酸(oleanolicacid，OLA)，又名庆四素，是一种生物活性物质，为一种五环三萜类化合物[1]。由于具有调节免疫功能、消炎、保肝护肾、抑制血小板凝集、降低血脂、血糖和抗病毒等多种生物活性，齐墩果酸及其衍生物的开发利用受到研究人员的关注，临床上齐墩果酸被用于治疗急性黄胆型和慢性中毒型肝炎，具有较好的疗效[1-4]。

自然条件下，齐墩果酸广泛存在于植物体内，其中以女贞子果皮的含量较高。迄今，人们发明了一些较为成熟的齐墩果酸提取纯化工艺，如乙醇浸提法[5]、大孔树脂吸附法[6]和大孔阴离子交换树脂提取法[7]。用乙醇浸提法从女贞子果皮中提取的齐墩果酸粗品，含有较多的脂溶性杂质，需要经过重结晶、酸碱处理等步骤进一步纯化，较为繁琐。用大孔树脂吸附法和在此基础上发展的大孔阴离子交换树脂法提取纯化齐墩果酸的新方法，一步制备的齐墩果酸含量达98%，但大孔阴离子交换树脂价格昂贵，且吸附性能不稳定，不适合工业化生产。因此，开发一种效果稳定、快速简便、成本较低的天然齐墩果酸纯化工艺十分必要。凝胶型阴离子交换树脂没有空隙结构，机械强度大，使用寿命长，价格便宜，适合在工业生产中应用。作者采用凝胶型阴离子交换树脂取代大孔阴离子交换树脂，对从女贞子果皮中提取的齐墩果酸粗品进行纯化，克服了现有方法的不足，收到了较好的效果。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

女贞子(Ligustrum lucidumAit)新鲜成熟果实采集于湖北理工学院校园内。

201x7型强碱性苯乙烯系凝胶型阴离子交换树脂，武汉金汉都化玻科教仪器有限公司；齐墩果酸对照品，98%，上海源叶生物科技有限公司；95%乙醇、石油醚、氢氧化钠、盐酸、酚酞试剂均为分析纯。

RE52CS型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；JA31002型精密电子天平、D2F-6050型真空干燥箱，上海申光仪器仪表有限公司；TENSOR27型傅立叶变换红外光谱仪，德国布鲁克科技有限公司；40～120目分样筛，东西湖科宇化验设备行。

1.2 齐墩果酸粗品的制备

参照文献[8]方法，将新鲜女贞子捣碎至皮仁分离后，用流水漂洗，收集果皮于80 ℃干燥后，按料液比1∶4(g∶mL)加入95%乙醇回流提取3次，每次1.0 h；合并提取液，按体积比1∶1加入石油醚萃取除去脂溶性杂质，乙醇层减压回收乙醇至浆状，加入纯化水洗涤，过滤，滤饼80 ℃干燥，即得齐墩果酸粗品。

1.3 齐墩果酸粗品的纯化

1.3.1 树脂的预处理

市售的凝胶型阴离子交换树脂比表面积小，交换容量不足。为此，本实验先将凝胶型阴离子交换树脂粉碎，使其颗粒变小，以提高其比表面积和离子交换容量。将粉碎的阴离子交换树脂过筛分级，取25 mL装柱，依次用10%氢氧化钠溶液、10%盐酸溶液、10%氢氧化钠溶液浸泡1.0 h，用纯化水冲洗至中性备用。

1.3.2 齐墩果酸的纯化

取2.0000 g齐墩果酸粗品溶解于30 mL 95%乙醇，上柱吸附1.0 h，先用一定体积分数的乙醇洗涤至洗脱液无色，再用2.0%氢氧化钠乙醇溶液洗脱(约30滴·min-1)，收集至洗脱液由亮黄色变成无色。洗脱液加10%盐酸溶液调pH值至弱酸性(pH值6.5)，真空减压浓缩成浆状，纯水洗涤后，减压抽滤，滤饼于80 ℃干燥至恒重，即得齐墩果酸精品。

1.4 纯化条件的优化

1.4.1 单因素实验

1)树脂粒度的影响

取40目、60目、80目、100目、120目的阴离子交换树脂颗粒，按1.3方法进行齐墩果酸粗品的纯化实验，过程中保持吸附和洗脱温度为10 ℃，洗脱液乙醇体积分数为95%，考察不同树脂粒度对齐墩果酸回收率和含量的影响。

2)吸附和洗脱温度的影响

用40目阴离子交换树脂按1.3方法进行纯化实验，洗脱液乙醇体积分数为95%，考察吸附和洗脱温度分别为5 ℃、10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃条件下，齐墩果酸回收率和含量的变化。

3)洗脱液乙醇体积分数的影响

用40目阴离子交换树脂按1.3方法进行纯化实验，吸附和洗脱温度为10 ℃，考察洗脱液乙醇体积分数分别为60%、70%、80%、90%、95%条件下，齐墩果酸回收率和含量的变化。

1.4.2 正交实验

在单因素实验的基础上，以树脂粒度、吸附和洗脱温度、洗脱液乙醇体积分数为影响因素设计正交实验(表1)，进一步优化纯化工艺条件。

表1 正交实验的因素与水平

1.5 分析检测

用化学法和红外光谱法对齐墩果酸精品进行定性检测。化学法：取样品约50 mg，加2 mL氯仿溶解，滴加硫酸2滴，振荡，静置观察。红外光谱法：取少量样品，与溴化钾混合后压片制样，进行红外光谱测定。

参照卫生部药品标准二部第三册方法测定齐墩果酸含量。具体操作为：准确称取样品0.15 g，加30 mL乙醇振摇，微温加热溶解，冷却至室温，滴加酚酞3滴，用氢氧化钾乙醇溶液滴定，并做空白实验校正。

2 结果与讨论

2.1 齐墩果酸粗品的回收率和含量(表2)

表2 女贞子果皮中提取齐墩果酸粗品的回收率和含量

本实验提取的齐墩果酸粗品为浅黄绿色粉末。每千克女贞子鲜果可制成干果皮64.50 g。从表2可知，回收率以女贞子果皮计平均为17.52%，以女贞子鲜果计为1.13%，酸碱滴定法测定含量平均为70.20%，3次平行实验的回收率和含量无显著差异。

2.2 齐墩果酸精品的定性检测

化学鉴别反应观察到氯仿自无色逐渐变成淡红色，与齐墩果酸标准品的反应现象相同。将样品红外光谱(图1)显示的羟基(3 424 cm-1)、饱和的CH(2 922 cm-1、2 850 cm-1)、羰基(1 686 cm-1)、甲基(1 468 cm-1、1 388 cm-1)、C-O伸缩振动(1 030 cm-1)等特征吸收峰及指纹区精细图谱与标准图谱进行对比，结果一致，因此，判断样品为齐墩果酸。

图1 齐墩果酸精品的红外光谱图(KBr压片法)

2.3 树脂粒度对齐墩果酸回收率和含量的影响(表3)

表3 树脂粒度对齐墩果酸回收率和含量的影响

从表3可知，随着树脂粒度的减小，齐墩果酸精品回收率升高，当树脂粒度为100目时，齐墩果酸回收率达到90%以上；当树脂粒度为120目时，样品溶液和洗脱液难以通过树脂层，实验无法进行。原因可能是树脂粒度减小，交换面积和交换容量增大，使齐墩果酸精品回收率升高；当树脂粒度进一步减小时，树脂之间的空隙严重变小，使液体流动速度减慢甚至停止。树脂粒度对齐墩果酸精品含量的影响不明显，说明离子交换法有效而且产品质量稳定可控。

2.4 吸附和洗脱温度对齐墩果酸回收率和含量的影响(表4)

表4 吸附和洗脱温度对齐墩果酸回收率和含量的影响

从表4可知，随着吸附和洗脱温度的升高，齐墩果酸的回收率先降低后升高；而齐墩果酸含量先升高后降低。原因可能是齐墩果酸和杂质的吸附-解吸行为在不同温度下有不同表现。考虑到吸附和洗脱一般在室温下进行，故没有考察低于5 ℃和高于40 ℃的条件。

2.5 洗脱液乙醇体积分数对齐墩果酸回收率和含量的影响(表5)

表5 乙醇体积分数对齐墩果酸回收率和含量的影响

从表5可知，随着洗脱液乙醇体积分数的增大，齐墩果酸回收率逐渐升高，当乙醇体积分数达到80%以上时，齐墩果酸的回收率趋于稳定；同时随着乙醇体积分数的增大，齐墩果酸含量逐渐升高，当乙醇体积分数达到80%以上时，含量已达98%以上。原因可能是在体积分数较高的乙醇中，齐墩果酸易于溶解并洗脱。综合考虑，宜选用体积分数为80%的乙醇溶液。

2.6 正交实验结果与分析(表6)

从表6可知，7#实验得到的齐墩果酸回收率最高，为96.33%，含量98.78%；9#实验得到的齐墩果酸回收率较高，为96.31%，含量98.64%；5#实验得到的齐墩果酸含量最高，为99.86%，回收率65.21%。

表6 正交实验结果与分析

5#实验虽然齐墩果酸含量最高，但回收率却相对较低，洗脱液乙醇体积分数较大，成本高；7#、9#实验回收率和产品含量都较高，但7#实验吸附和洗脱温度低、乙醇体积分数大，成本高。

综合考虑，优化的纯化工艺条件采用9#实验的参数，即树脂粒度100目、吸附和洗脱温度30 ℃、洗脱液乙醇体积分数80%。

2.7 优化条件下纯化效果的稳定性(图2)

图2 优化工艺条件下连续10次纯化实验结果

由图2可知，同一批阴离子交换树脂连续进行10次纯化实验，齐墩果酸回收率和含量无显著变化，说明树脂的吸附性能稳定。树脂颜色由最初的微黄色变为棕色，可能是杂质渗入树脂内部所致，但对实验效果无显著影响。

3 结论

通过单因素实验和正交实验，探讨了凝胶型强碱性阴离子交换树脂对从女贞子果皮中提取的齐墩果酸粗品的纯化效果。分别比较了树脂粒度、吸附和洗脱温度、洗脱液乙醇体积分数对齐墩果酸回收率和含量的影响。确定最优工艺条件为：树脂粒度100目、吸附和洗脱温度30 ℃、洗脱液乙醇体积分数80%。在此条件下，凝胶型强碱性阴离子交换树脂纯化齐墩果酸的精品纯度达98%以上，且质量稳定；齐墩果酸回收率可达96%以上。

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[7] 张宝堂，刘庚贵.一种从女贞子中提取含量不低于98%的齐墩果酸的生产方法：CN 201010561799.3[P].2010-11-26.

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Purification Technology of Oleanolic Acid Based on a Gel-Type Anion Exchange Resin

YANG Yu-qi1，2，LIU Yuan-he2，WANG Can2，ZHANG Nan-hai2，HUANG Qi-hong2，LI Yun-lei2，WU Yi-wei1

(1.HubeiNormalUniversity，Huangshi435002，China；2.HubeiPolytechnicUniversity，Huangshi435001,China)

ThecrudeoleanolicacidfromthepeelofLigustrum lucidumAitwaspurifiedusingagel-typeanionexchangeresins,andthepurifiedconditionswereoptimizedbyasinglefactorexperimentandorthogonalexperiment.Theoptimalconditionswereasfollowing:theparticlesizeofresinof100meshes,theadsorptionandelutiontemperatureof30 ℃,andtheethanolvolumefractionof80%.Thecontentandyieldofoleanolicacidwereover98%and96%,respectively.

oleanolicacid；gel-typeanionexchangeresin；purification

湖北省高等学校优秀中青年创新团队项目(201317)

2016-09-29

杨裕启(1975-)，男，湖北黄石人，实验师，研究方向：天然药物提取和分析；通讯作者：吴一微，教授，E-mail：chemwuyiwei@163.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.11.007

杨裕启，刘远河，王灿，等.基于凝胶型阴离子交换树脂的齐墩果酸纯化工艺[J].化学与生物工程，2016，33(11)：36-39.

R 284

A

1672-5425(2016)11-0036-04