miR-486、miR-499在肺癌患者血浆中的表达及临床价值

杨阳，杨晴，贾友超，李小芳，杨华，张倩，彭鑫宇，臧爱民△

miR-486、miR-499在肺癌患者血浆中的表达及临床价值

杨阳1，2，杨晴3，贾友超2，李小芳2，杨华2，张倩2，彭鑫宇4，臧爱民2△

目的探讨miR-486和miR-499在肺癌患者血浆中的表达及临床意义，分析其在非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC）中表达的差异。方法收集35例肺癌患者（其中NSCLC组21例，SCLC组14例）及30例健康者（对照组）血样标本，运用qPCR的方法测定各组血浆miR-486、miR-499的表达量，分析NSCLC和SCLC患者血浆中miR-486和miR-499的表达量与各临床特征的关系。对所有入组者血浆miRNA的相对表达量进行ROC曲线分析，计算曲线下面积（AUC）、最佳临界值及其敏感度和特异度。结果NSCLC和SCLC组中血浆miR-486、miR-499的相对表达量均低于对照组（P＜0.05）。NSCLC组血浆miR-486在不同临床特征患者间表达差异均无统计学意义；而TNM分期越晚、分化程度越低，miR-499表达越低（P＜0.05）。SCLC组分期越晚，miR-486表达越低；而miR-499在不同临床特征患者间表达差异均无统计学意义。miR-486诊断肺癌的AUC为0.83（95%CI为0.73～0.93），敏感度和特异度分别为90.0%和68.6%，最佳诊断界值为1.02；miR-499诊断肺癌的AUC为0.75（95%CI为0.62～0.88），敏感度和特异度分别为60.0%和94.3%，对肺癌的最佳诊断界值为0.32。结论血浆miR-486、miR-499在肺癌患者中表达下调，可能预示预后不良，有望作为肺癌潜在筛查及预后的指标。

癌，非小细胞肺；微RNAs；血浆；敏感性与特异性；诊断，鉴别；miR-486；miR-499

近些年来恶性肿瘤的发病率和死亡率不断攀升，2015年我国新患恶性肿瘤人数有42 924 292例，因恶性肿瘤死亡人数达2 814 000例，其中肺癌的发病率和死亡率高居首位［1］。研究显示，2/3的肺癌患者确诊时往往已经是晚期，由于缺少有效的治疗方法，5年生存率只有15%左右［2］。因此，迫切需要找到早期诊断肺癌的有效方法。微小RNA（microRNA，miRNA）是一种小分子RNA，能调节特定的信使RNA，在肺癌组织及外周循环中miRNA的表达不但参与肺癌发生、发展，而且还与疾病的诊断、分期、进展和预后密切相关［3］。血浆中的miRNA无论在体内和体外都以一种稳定状态存在，不容易受到体内内源性核糖核酸酶及体外强酸、强碱、高温环境的影响，具备了作为潜在肿瘤标志物的基本条件［4-5］。有研究证实血浆中miR-486-5-p可能发挥肿瘤抑制作用，可能作为非小细胞肺癌（NSCLC）诊断、治疗、预后评判的潜在指标［6］。NSCLC血浆中miR-499的表达可能参与肿瘤发生、发展。在应用抗肿瘤化疗药物的过程中，血浆中miR-499还可能参与调节某些肿瘤相关基因，从而导致肿瘤细胞发生免疫逃逸、入侵及转移，最终导致预后不良［7］。既往大多数研究关注的热点集中在NSCLC的血浆中miRNA的表达情况，本实验通过分析NSCLC、小细胞肺癌（SCLC）患者血浆中miR-486、miR-499的表达情况，探讨其作为抑癌基因的作用，为肺癌诊断及预后判断提供新的思路。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取2014年1月—2015年1月河北大学附属医院肿瘤内科收治的肺癌患者35例，以2004年版WHO肺肿瘤组织学分类标准为依据，经支气管镜或者肺肿物穿刺病理结果证实为肺恶性肿瘤。35例中NSCLC 21例（NSCLC组），其中腺癌14例、鳞癌7例；SCLC 14例（SCLC组）。NSCLC组男12例，女9例，年龄≤60岁者12例，吸烟者10例。SCLC组男11例，女3例，年龄≤60岁者5例，吸烟者10例。纳入标准：（1）姓名、年龄、性别、吸烟史、家族史等个人资料完整。（2）入院前从未接受放疗、化疗或其他针对肿瘤的治疗。另取常规体检人群30例为对照组，既往均无任何肿瘤病史，其中男16例，女14例，年龄≤60岁者14例，吸烟者14例。3组性别（χ2=2.693）、年龄≤60岁（χ2=1.570）、吸烟（χ2=2.619）构成差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。所有入组者均签署知情同意书，并经过本院伦理委员会批准。

1.2 主要仪器与试剂实时荧光PCR仪（美国Bio-Rad，CFX96）；高速低温离心机（美国Thermo CENTRIFUGE PK 121R）、移液器（Eppendorf）；漩涡振荡器、干浴恒温器（江苏其林贝尔）；通风橱、冻存盒（Invitrogen）；-80℃冰箱（Thermo）；miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control 10 pmol（德国QIAgen，货号：219610）；RNase-free水（碧云天）、无水乙醇（广州化学试剂厂）；All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection kit（美国GeneCopoeia公司）。

1.3 血液标本的收集与储存用EDTA抗凝管收集各组患者外周血5 mL，于4℃、2 000 r/min离心10 min，将分离得到的上层血浆2 h内分装至EP管中置于-80℃长期保存。

1.4 荧光定量PCR法检测miR-499和miR-486的表达水平解冻血浆样本，于离心管中按照200 μL血浆加入1 000 μL QIAzol Lysis Reagent裂解液（1∶5）裂解样品。按试剂盒说明书提取总RNA。检测RNA浓度、纯度，由于血浆样本中的RNA为游离的RNA，RNA含量较低，无法通过电泳法得到证实，本研究仅通过qPCR结果来判定。按试剂盒说明逆转录合成cDNA，逆转录引物序列见表1。miRNA荧光定量检测：采用荧光定量PCR法检测miR-499和miR-486在各组血浆样本中的表达水平。miR-499、miR-486及cel-39mimic（内参）的上下游引物均购自广州金域医学检验中心。qPCR检测反应液的配制：10 μL 2×All-in-One qPCR Mix；2 μL qPCR Forward Primer（2 μmol/L）；1 μL Universal PCR primer（2 μmol/L）；2 μL First strand cDNA；5 μL ddH2O。qPCR反应程序：95℃预变性10 min，循环1次；95℃变性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸10 s，重复40个循环，然后进行熔解曲线分析。每个组织样本做3次平行试验，采用2-ΔΔCt来分析miRNA的相对表达量。

Tab.1Primer sequences of reverse transcrption表1 逆转录引物序列

1.5 统计学方法采用SPSS 19.0统计学软件处理。计量资料符合正态分布的用均数±标准差描述，不符合正态分布的用M（P25，P75）描述。非正态分布的计量资料2组间比较采用Wilcoxon秩和检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis H秩和检验。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。利用ROC曲线分析miR-486和miR-499表达量诊断肺癌最佳临界值、敏感度与特异度。所有统计检验均为双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组miR-486、miR-499表达水平比较NSCLC组和SCLC组中miR-486、miR-499表达水平均低于对照组（P＜0.05），SCLC组与NSCLC组间差异均无统计学意义，见表2。

Tab.2Comparison of relative expression levels of miR-486 and miR-499 between three groups表2 各组miR-486、miR-499的相对表达水平比较M（P25，P75）

2.2 NSCLC组miR-486和miR-499的相对表达量与临床特征的关系NSCLC组血浆miR-486在不同临床特征间差异均无统计学意义；而TNM分期越晚、分化程度越低，miR-499表达越低（P＜0.05），见表3。

Tab.3Relationship between plasma expression levels of miR-486 and miR-499 with clinical features in NSCLC group表3 NSCLC组血浆中miR-486、miR-499的表达与临床特征的关系M（P25，P75）

2.3 SCLC组miR-486和miR-499的相对表达量与临床特征的关系SCLC组血浆miR-486在肿瘤局限期和广泛期间表达水平差异有统计学意义（P＜0.05），即分期越广泛miR-486表达越低；而miR-499在不同临床特征间差异均无统计学意义，见表4。

Tab.4Relationship between plasma expression levels of miR-486 and miR-499 with clinical features in the SCLC group表4 SCLC组血浆中miR-486、miR-499的表达与临床特征的关系M（P25，P75）

2.4 miR-486和miR-499的相对表达量对肺癌的诊断价值ROC曲线显示，miR-486诊断肺癌的曲线下面积（AUC）为0.83（95%CI：0.73～0.93），敏感度和特异度分别为90.0%和68.6%，最佳诊断界值为1.02；miR-499诊断肺癌的AUC为0.75（95%CI：0.62～0.88），敏感度和特异度分别为60.0%和94.3%，对肺癌的最佳诊断界值为0.32，见图1。。

Fig.1ROC curves of relative plasma expressions of miR-486 and miR-499 in the diagnostic value of lung cancer图1 血浆中miR-486和miR-499相对表达量对肺癌诊断价值的ROC曲线

3 讨论

miRNAs是一类高度保守、长度很短的非编码调控单链RNA，长度约19～25 nt，其广泛存在于真核生物体内，参与肿瘤的发生发展、外侵转移和转归预后等多个环节［8］。Croce实验室研究显示，超过半数的miRNA基因存在于肿瘤相关基因中，miR-15a、miR-16a在慢性淋巴细胞白血病标本中表达缺失或下调［9］。有研究认为，miR-21、miR-210、miR-126、miR-486可以作为诊断NSCLC的参考指标［10］。Hu等［11］研究证实，NSCLC患者共有11种miRNA的表达量较正常情况下上调5倍之多，其中miR-1、miR-499、miR-486、miR-30d与NSCLC总生存率相关，有望作为NSCLC患者的预后指标。

本研究结果显示，NSCLC组和SCLC组血浆中miR-486表达水平均明显低于对照组，与既往研究结果基本一致［10-11］，且ROC曲线示miR-486诊断肺癌的AUC为0.83，接近0.90，具有中等诊断效率，提示血浆中miRNA-486表达水平的高低可能成为肺癌的非侵入性生物标志物，可用于肺癌早期检测。NSCLC组血浆miR-486在不同临床特征间差异均无统计学意义；而在SCLC组中分期越晚，miR-486表达越低，提示miR-486可能是SCLC预后的影响因素。

目前，有关血浆miR-499的研究通常集中在心肌损伤和心肌梗死之间的关联［12］。急性心肌梗死患者血浆中miR-499低表达，预示其可能成为早期检测心肌损伤的生物标志物［12］。Donaldson等［13］研究发现，血浆miR-499在慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者中明显升高。Vinci等［14］研究发现，miR-499在NSCLC组和对照组中表达差异并无统计学意义；本研究结果显示，血浆miR-499在NSCLC和SCLC患者中表达水平均低于对照组，与Vinci等［14］学者的研究结论不完全相同，考虑可能与血浆中miR-499含量偏低，样本量小及操作者的技术水平有关，需要大规模前瞻性临床试验进一步验证。NSCLC患者的TNM分期越晚、分化程度越低，miR-499表达越低，与既往研究结果类似［7,14］，提示血浆miR-499有可能作为NSCLC预后的生物标志物。

综上所述，血浆miR-486、miR-489在肺癌患者中表达下调，均有可能与肺癌的发生及预后密切相关，有望作为肺癌潜在筛查及预后指标。但是本研究样本量较小、血浆中的miRNA的量较少，定量PCR的准确性可能降低，这2个miRNA是否为肺癌特异来源尚有待确定。

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（2016-06-12收稿2016-09-19修回）

（本文编辑陆荣展）

The expression and clinical significance of plasma miR-486 and miR-499 in patients with lung cancer

YANG Yang1,2,YANG Qing3,JIA Youchao2,LI Xiaofang2,YANG Hua2,ZHANG Qian2,PENG Xinyu4,ZANG Aimin2△
1 Hebei University,Baoding 071002,China;2 Hebei Key Laboratory of Cancer Radiotherapy and Chemotherapy,Department of Medical Oncology,the Affiliated Hospital of Hebei University;3 Department of Blood Transfusion, 4 Department of Hepatobiliary Surgery,the Affiliated Hospital of Hebei University△

ObjectiveTo explore the expression levels of miR-486 and miR-499 in the plasma of lung cancer patients,and analyze their expression differences in non-small cell lung cancer(NSCLC)and small cell lung cancer(SCLC). MethodsBlood samples were collected in 35 patients with lung cancer(21 NSCLC and 14 SCLC)and 30 healthy persons (control group).The real-time quantitative PCR was used to detect the expression levels of plasma miR-486 and miR-499 in two groups.The plasma levels of miRNA-486 and miRNA-499 and their correlation with various clinical features in NSCLC and SCLC patients were analyzed.The receiver operating characteristic curves（ROC）of miRNA expressions were analyzed.The area under a curve（AUC）,threshold and the sensitivity and specificity were calculated.ResultsThe expression levels of miR-486 and miR-499 were significantly lower in NSCLC and SCLC groups than those of the control group（P＜0.05).There were no significant differences in the expression of miR-486 between different clinical features in NSCLC group.For the late cancer TNM staging,the tumor differentiation was lower,and the miR-499 expression level was lower(P＜0.05).In SCLC group,for the late cancer staging,there was a lower expression level of miR-486.There were no significant differences in the expressions of miR-499 between different clinical features.The miRNA-486 AUC in the diagnosis of lung cancer was 0.83(95%CI:0.73-0.93),the sensitivity and specialty rates were 90.0%and 68.6% respectively,and the best diagnostic value was 1.02.The miRNA-499 AUC in the diagnosis of lung cancer was 0.75(95% CI:0.62-0.88),the sensitivity and specialty rates were 60.0%and 94.3%respectively,and the best diagnostic boundary value was 0.18 for lung cancer.ConclusionThe plasma expression levels of miR-499 and miR-486 are down-regulated in lung cancer patients,which suggest a poor prognosis and can be used as potential screening and prognostic indicators forlung cancer.

carcinoma,non-small-cell lung；microRNAs；plasma；sensitivity and specificity；diagnosis,differential；miR-486；miR-499

R734.2

A

10.11958/20160528

2015年河北省政府资助临床医学优秀人才项目（361007）

1河北大学（邮编071002）；2河北省放化疗机制与规程重点实验室，河北大学附属医院肿瘤内科；3输血科，4肝胆外科

杨阳（1985），男，硕士在读，主要从事肺癌分子生物学研究

△通讯作者E-mail:booszam@sina.com