热敏灸对脑缺血再灌注损伤大鼠大脑皮质CD11b表达的影响

龚丽丽，张毫，谢斌，欧阳昕，肖爱娇△

热敏灸对脑缺血再灌注损伤大鼠大脑皮质CD11b表达的影响

龚丽丽1，张毫1，谢斌1，欧阳昕2，肖爱娇1△

目的制备局灶性脑缺血性再灌注损伤大鼠模型，观察热敏灸对模型大鼠大脑皮质CD11b表达的影响。方法雄性SD大鼠51只，采用随机数字表法将大鼠分为假手术组（n=10）、模型组（n=14）、艾灸组（n=27）。艾灸组根据艾灸前后尾温变化再分为非热敏灸组（n=13）和热敏灸组（n=14）。应用线栓法制备局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠模型。采用神经功能缺失评分法观察大鼠的行为学表现；光照测痛仪测定大鼠的甩尾潜伏期；TTC染色法观察大鼠的脑梗死面积；免疫组织化学法检测大脑皮质CD11b的表达。结果术后3 d时，非热敏灸组（9.32±1.11）s与热敏灸组（8.69±0.51）s大鼠甩尾潜伏期均明显短于模型组（12.21±1.04）s，以热敏灸组缩短更为明显；非热敏灸组（20.59±2.25）%和热敏灸组（13.18±3.50）%大鼠脑梗死面积小于模型组（32.22±14.20）%，以热敏灸组缩小更为明显；非热敏灸组（5.40±0.58）和热敏灸组（2.89±0.71）大鼠大脑皮质CD11b表达低于模型组（7.83±1.60），以热敏灸组降低更为明显。结论热敏灸具有改善大鼠的感觉功能、减轻大鼠脑缺血再灌注损伤的作用，减少大脑皮质CD11b的表达、减轻炎症反应可能是其作用机制之一。

艾炷灸；脑缺血；再灌注损伤；抗原，CD11b；大鼠，Sprague-Dawley；甩尾潜伏期

脑血管病（cerebrovascular disease，CVD）具有较高的发病率、死亡率和致残率。在所有的脑血管病中，尤以缺血性脑血管病（ischemic cerebrovascular disease，ICVD）发病率最高，约占脑血管病总体发病率的60%～80%［1］，现临床上一般采用溶栓疗法［2］等血管再通技术使缺血性脑组织重新恢复血液灌注，有时反而可加重组织的功能障碍和结构损伤，即发生脑缺血再灌注损伤。研究表明，热敏灸对多种疾病有良好的疗效［3］，其治疗缺血性脑卒中也取得了较好的效果［4］。本课题组前期动物实验结果显示热敏灸能够缩小脑缺血再灌注损伤模型大鼠的脑梗死面积、减轻脑缺血再灌注损伤［5-8］。然而其作用机制尚不十分清楚。近年来，许多研究表明，炎症反应参与了脑缺血再灌注损伤的发病过程［8-9］。小胶质细胞（Microglia）是中枢神经系统的重要免疫细胞，CD11b是该细胞活化的重要标志物。研究报道，脑缺血再灌注数小时后，缺血侧CD11b阳性细胞表达明显增加［10-11］。那么，热敏灸减轻脑缺血再灌注损伤是否通过降低大鼠脑缺血再灌注损伤模型脑组织中CD11b表达、减轻炎症反应起作用还不十分清楚。本研究在前期工作的基础上，进一步探讨热敏灸减轻脑缺血再灌注损伤的作用机制，为热敏灸用于临床治疗缺血性卒中提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与分组清洁级SD大鼠51只，雄性，体质量200～220 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。适应性喂养3 d，采用随机数字表法将大鼠分为假手术组（10只）、模型组（14只）和艾灸组（27只）。模型组：行大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）手术，2 h后行再灌注，术后单笼饲养。假手术组：同模型组，但不插栓线。艾灸组：在模型组基础上于再灌注次日给予艾灸“大椎”治疗，1次/d，35 min/次，共3 d。根据艾灸前后尾温差，艾灸组大鼠再分为非热敏灸组（艾灸前后尾温差未满足热敏灸组条件者，13只）和热敏灸组（艾灸后尾温升高，与艾灸前尾温差超过1℃，且3次测量中2次超过者，14只）。纳入标准：再灌注即刻神经功能缺失评分为1～3分以及再灌注72 h后仍存活者。

1.1.2 主要试剂与仪器CD11b抗体（ab75476，英国abcam公司），辣根酶标记山羊抗兔IgG（ZB-2301，北京中杉金桥生物技术有限公司）。鼠尾光照测痛仪（YLS-12A，济南益延科技发展有限公司）；冰冻切片机（CM1950，德国Leica公司）；显微镜及图像分析系统（Leica 2000，德国Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 局灶性脑缺血再灌注损伤模型的制备釆用10%的水合氯醛（3 mL/kg）进行腹腔注射达到深度麻醉后，大鼠仰卧位固定，暴露颈部，剪去颈部鼠毛，用75%乙醇消毒，行颈部正中线2 cm左右切口，用血管钳钝性分离左侧颈部肌肉及筋膜，分出左侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉及迷走神经等，分别用手术丝线在左侧颈总动脉近心端，颈外动脉分叉处予以结扎，靠近颈总动脉分叉处绕线暂不结扎死。然后将颈内动脉用微动脉夹夹闭，在颈总动脉距离颈外动脉分叉处2～3 mm用医用眼科手术剪剪一斜形的切口，用眼科镊将栓线朝头部方向经切口处缓慢插入栓线，并轻推栓线至微动脉夹处，将事先准备的丝线适度结扎以减少或避免出血，然后将微动脉夹取下，用医用眼科手术镊将栓线缓慢插入颈内动脉，栓线进入深度距颈总动脉分叉处约为18～22 mm，将颈内动脉分叉处的手术线系紧。术后2 h进行再灌注，即拔出一部分栓线，但不能完全拔出。

1.2.2 艾灸取穴与方法（1）穴位选择：以针灸传统理论为依据，“大椎”内可通行督脉，外可流走于三阳，除能调节本经经气外，还可以调节六阳经经气，泻之可清泻诸阳经之邪热盛实、通督解痉；补之可壮全身之阳、固卫安营［12］，所以治疗脑缺血再灌注损伤取治疗穴“大椎”。（2）艾灸方法：用直径0.4 cm，长10 cm艾条，距大椎穴位约2 cm处温和灸大鼠，1次/d，35 min/次，共3 d。

1.2.3 神经功能缺失评分于再灌注后0 h，参考Longa等［13］的5分制法对各组大鼠进行评分。0分：无神经损伤症状，活动正常。1分：不能完全伸展右侧前爪。2分：向右侧转圈。3分：向右倾倒。4分：大鼠不能自发行走，意识丧失。分值越高，动物行为障碍将越严重。

1.2.4 甩尾潜伏期测定于术后2 h、1 d、3 d使用鼠尾光照测痛仪进行测定。其基本原理是将一束光照射到鼠尾某个部位上产生集热效应，使鼠尾局部温度升高，当温度升到一定程度，而产生疼痛。但疼痛超过动物能忍受的痛阈时，动物就产生有效的甩尾逃避，以判断艾灸对动物痛阈的影响。对各组大鼠进行测定，每个时间点每只大鼠测2次，取平均值。

1.2.5 大脑皮质CD11b蛋白表达检测采用免疫组化法进行检测。于脑缺血再灌注后3 d，每组3只大鼠用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射达到深度麻醉后在冰上取脑，分离左侧大脑皮质，切取小块置于4%多聚甲醛溶液中后固定4～6 h，然后透明、浸蜡、包埋、切片。每只大鼠取1～2片、贴片、拷片、脱蜡、水化、PBS液清洗、抗原修复、封闭、滴加兔抗鼠CD11b抗体（1∶300）、PBS液清洗、滴加辣根酶标记山羊抗兔（1∶500）、DAB显色、苏木精复染等，风干，中性树胶封片，显微镜观察和拍照。图中棕褐色为CD11b染色阳性细胞，用IPP算出其平均光密度。

1.2.6 脑组织梗死检查采用TTC染色进行检测。于脑缺血再灌注后3 d，每组剩余大鼠用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射达到深度麻醉后在冰上取脑，将脑放-20℃冰箱冷冻20 min，以2 mm左右间隔自前额向枕后切成5个冠状切片，然后将脑片放入1%TTC染液中，置于37℃恒温箱中染色20 min，用甲醛溶液进行固定后拍照，用IPP软件计算脑梗死面积与全脑面积的百分比。

1.3 统计学方法采用SPSS 17.0进行统计分析，数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用Dunnett-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能缺失评分大脑中动脉缺血再灌注后，模型组、非热敏灸组和热敏灸组大鼠均出现各种不同程度的神经功能障碍，如提尾时大鼠的右侧前肢不能伸展，行走时会向右侧旋转或倾倒等；其神经功能缺失评分为1～3分。假手术组大鼠无神经功能障碍表现，神经功能缺失评分为0分，见表1。

Tab.1Neurologic deficit scores,percentage of infarct volume and CD11b expression in four groups of rats表1 各组大鼠神经功能缺失评分、脑梗死面积百分比和CD11b表达结果

Tab.1Neurologic deficit scores,percentage of infarct volume and CD11b expression in four groups of rats表1 各组大鼠神经功能缺失评分、脑梗死面积百分比和CD11b表达结果

＊＊P＜0.01；a与假手术组相比，b与模型组相比，c与非热敏灸组相比，P＜0.05

组别假手术组模型组非热敏灸组热敏灸组F n 10 14 13 14神经功能缺失评分（分）0 2.26±0.63a 2.29±0.74a 2.38±0.77a 39.647＊＊n7 1 1 10 11脑梗死面积百分比（%）0 32.22±14.20a 20.59±2.25ab 13.18±3.50abc 88.782＊＊n3 3 3 3 CD11b表达1.35±0.33 7.83±1.60a 5.40±0.58ab 2.89±0.71abc 258.267＊＊

2.2 热敏灸对脑缺血再灌注损伤模型大鼠甩尾潜伏期的影响术后2 h时，与假手术组相比，模型组、非热敏灸组和热敏灸组大鼠的甩尾潜伏期延长，差异有统计学意义；术后1 d时，各组大鼠甩尾潜伏期均有所缩短，但与假手术组相比，模型组、非热敏灸组和热敏灸组大鼠的甩尾潜伏期仍然较长，差异有统计学意义；术后3 d时，模型组的甩尾潜伏期明显长于假手术组，而非热敏灸组与热敏灸组大鼠甩尾潜伏期均明显短于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

Tab.2Results of tail-flick latency in four groups of rats表2 各组大鼠甩尾反应潜伏期结果（s，）

Tab.2Results of tail-flick latency in four groups of rats表2 各组大鼠甩尾反应潜伏期结果（s，）

＊P＜0.05；a与假手术组相比，b与模型组相比，P＜0.05

组别假手术组模型组非热敏灸组热敏灸组F n 甩尾潜伏期10 14 13 14 2 h 3.90±0.57 13.03±2.10a13.09±0.90a12.52±0.71a10.382＊1 d 3.73±0.48 12.91±1.60a12.95±1.28a12.01±0.95a3.757＊3 d 3.97±0.80 12.21±1.04a9.32±1.11ab8.69±0.51ab2.821＊

2.3 热敏灸对脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑梗死面积的影响手术后3 d，假手术组大鼠脑组织全部染成红色，无梗死灶；模型组、非热敏灸组和热敏灸组大鼠左侧半球有白色梗死灶，其余部分呈红色。经统计，非热敏灸组和热敏灸组脑梗死面积均较模型组缩小，尤以热敏灸组缩小更为明显，见表1、图1。

Fig.1The infarct areas of rat brain detected by TTC staining图1 各组大鼠脑组织TTC染色情况

2.4 热敏灸对脑缺血再灌注损伤模型大鼠大脑皮质CD11b表达的影响假手术组大鼠大脑皮质CD11b表达较少；与假手术组相比，模型组CD11b表达增多，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，非热敏灸组和热敏灸组CD11b的表达减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；与非热敏灸组相比，热敏灸组CD11b的表达减少，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1、图2。

Fig.2The expression of CD11b protein in rat cortex detected by immunohistochemical staining图2 免疫组织化学法检测大脑皮质CD11b的表达结果（比例尺=50 μm）

3 讨论

热敏灸疗法是我校陈日新教授、主任中医师历经多年的临床实践、科学研究基础上首创的艾灸新疗法［3］，大幅度提高了临床灸疗疗效。临床观察发现，与传统悬灸相比，热敏灸的灸量不同［4］。传统悬灸的灸量每次每穴一般为10～15 min，或者以局部皮肤潮红为度，往往达不到治疗个体化的最佳灸量；而热敏灸通常需要较长时间，一般为30～60 min。本课题组前期实验观察到，艾灸“大椎”穴35 min能显著缩短脑缺血再灌注损伤模型大鼠的甩尾潜伏期，缩小脑梗死面积，减轻脑缺血再灌注损伤，疗效优于艾灸“大椎”穴15 min［5-8］。

艾灸“大椎”穴35 min是否都可达到明显的效果，都属于热敏灸？根据陈日新教授潜心二十多年的临床研究结果，采用悬灸法灸热敏穴位时可表现出以下6种灸感现象［3］：（1）透热。即灸热从施灸处表面透向深部组织甚至五脏六腑。（2）扩热。即灸热由灸点向四周扩散。（3）传热。即灸热由灸点沿着某一条线路向远处甚至病所传导。（4）局部不热或微热，远部热。即灸点不热或微热，但离灸点远处热。（5）表面不热或微热，深部热。即灸点表面不热或有微热，但灸点皮下深部组织等有热感。（6）产生其他非热的感觉。即灸点或远离灸点处产生麻、酸、胀、痛等不是热的感觉的奇异灸感现象。悬灸穴位产生上述1种或几种灸感就称为热敏穴位，同时这些灸感传导之处，病症将有所缓解。

为此，本文在前期实验研究基础上，依据传热现象，根据艾灸前后尾温差将艾灸组大鼠再分为非热敏灸组与热敏灸组，结果显示，热敏灸能显著缩短脑缺血再灌注损伤模型大鼠的甩尾潜伏期，改善大鼠的感觉功能；缩小脑梗死面积，减轻脑缺血再灌注损伤，且疗效优于非热敏灸。上述结果表明，艾灸非热敏穴位能产生一定疗效，但艾灸热敏穴位疗效比艾灸非热敏穴位的疗效好，与文献［14］研究结果基本一致。那么，热敏灸如何发挥减轻脑缺血再灌注损伤？

许多研究显示，在脑缺血再灌注引起的脑组织损伤进展过程中，有许多相互关联的机制在起作用，涉及的主要病理生理过程很多，如兴奋性毒性、炎症、血管通透性改变、氧化应激和细胞凋亡等［15］。其中，炎症反应促进了继发性脑损伤的发生，是脑缺血再灌注损伤的主要原因之一［8-9,16］。炎性细胞浸润是炎症反应的重要特征，在炎症反应中起了十分重要的作用。这些炎性细胞（如小胶质细胞、白细胞）在发挥吞噬作用、免疫作用的同时，向细胞外释放大量氧自由基、细胞因子、溶酶体酶等炎症介质，加重脑组织损伤，引起脑缺血再灌注损伤。本课题组前期研究观察到：大鼠大脑中动脉缺血再灌注后3 d，患侧脑组织中出现大量炎性细胞浸润［8-9］，表明炎症反应参与了脑缺血再灌注损伤的病理过程。

小胶质细胞是脑内特殊的免疫活性细胞，是巨噬细胞的一种。活化的巨噬细胞在病原体等刺激下，一方面可发挥抗感染免疫作用，另一方面也可产生大量促炎细胞因子和其他炎症介质，介导炎症反应。CD11b是小胶质细胞活化的重要标志物，有研究报道，脑缺血再灌注数小时后，缺血侧CD11b阳性细胞表达明显增加［10-11］。本研究观察到，脑缺血再灌注后3 d，患侧大脑皮质CD11b表达明显增加，与上述研究结果基本一致，而经艾灸治疗后，患侧大脑皮质CD11b表达减少，以热敏灸组减少更为显著。上述研究结果提示，艾灸热敏化“大椎”穴可能大大激发和调动了机体自身的抗病能力，降低脑组织中CD11b的表达，减少小胶质细胞等炎性细胞浸润，减轻炎症反应，从而减轻脑缺血再灌注损伤。

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（2016-04-28收稿2016-08-18修回）

（本文编辑魏杰）

Effects of heat-sensitive moxibustion on the expression of CD11b in cortex of focal cerebral ischemia-reperfusion injury model rats

GONG Lili1,ZHANG Hao1,XIE Bin1,OUYANG Xin2,XIAO Aijiao1△
1 Basical Medical School,2 Class One Grade 2015,Science of Acupuncture,Moxibustion and Rehabilitation, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330004,China△

ObjectiveTo observe the effect of heat-sensitive moxibustion on the expression of CD11b in focal cerebral ischemia/reperfusion(I/R)injury model rats.MethodsFifty-one male SD rats were randomly divided into three groups, sham-operated group(n=10),I/R injury group(n=14)and moxibustion group(n=27).According to changes of tail temperature before and after moxibustion,moxibustion group was subdivided into non heat-sensitive moxibustion group(n= 13)and heat-sensitivel moxibustion group(n=14).Focal cerebral ischemia-reperfusion injury was induced by middle cerebral artery occlusion for 2 hours and reperfusion for 3 days.Behavioral performance was tested using neurologic deficitscores.Tail-flick latency was determined with tail flick analgesia meter.Infarct areas were examined using TTC staining, and cortical expression of CD11b was measured using immunohistochemical staining.ResultsAfter 3 d of operation,the tail-flick latency was significantly shorter in non heat-sensitive moxibustion group(9.32±1.11)s and heat-sensitive moxibustion group(8.69±0.51)s than that of model group(12.21±1.04)s.The area of cerebral infarction was smaller in non heat-sensitive moxibustion group(20.59±2.25)%and heat-sensitive moxibustion group(13.18±3.50)%than that in model group(32.22±14.20)%.Compared with model group,the expression of CD11b was significantly decreased in non heatsensitive moxibustion group and heat-sensitive moxibustion group(P＜0.05).ConclusionHeat-sensitive moxibustion can reduce the damage of cerebral inchemia-reperfusion,which might be through decreasing expression of CD11b.

Moxa Cone Moxibustion;brain ischemia;reperfusion injury;antigens,CD11b;rats,Sprague-Dawley;tailflick latency

R743

A

10.11958/20160554

国家自然科学基金资助项目（81060305，81660819）；江西省自然科学基金资助项目（20151BAB205068，20161BBH80053）；江西省卫生计生委中医药科研计划项目（2014Z003）；江西中医药大学课题（2014ZR018，2015JZZDXK024）

1江西中医药大学基础医学院（邮编330004），2 2015级针康1班

龚丽丽（1988），女，硕士研究生，主要从事中医药防治神经疾病基础研究工作

△通讯作者E-mail：xaj527@163.com