纳米二氧化硅致心肌线粒体损伤作用的研究

梁宝璐，杨曼，吴鹏，李艳博，荆黎，孙志伟

纳米二氧化硅致心肌线粒体损伤作用的研究

梁宝璐，杨曼，吴鹏，李艳博，荆黎△，孙志伟

目的研究纳米二氧化硅对心肌细胞线粒体的毒性作用及机制。方法采用非暴露式气管内滴注的染毒方式对Balb/c小鼠进行3种浓度（7、21和35 mg/kg）粒径为40 nm左右的纳米二氧化硅暴露，另设对照组滴注等体积生理盐水。通过透射电子显微镜对小鼠心肌线粒体超微结构进行观察。通过对三磷酸腺苷（ATP）浓度的检测，评价纳米二氧化硅对心肌线粒体功能的影响。通过对心肌组织抗O2-·能力的检测，评价心肌细胞线粒体抗氧化能力。采用Western blot法对心肌组织中细胞色素c氧化酶1（COX1）和琥珀酸脱氢酶A（SDHA）蛋白表达水平进行检测，从而阐明纳米二氧化硅对心肌细胞线粒体生物合成的影响。结果与对照组相比，高剂量的纳米二氧化硅可导致线粒体结构的损伤，主要表现为线粒体肿胀、线粒体嵴排列紊乱甚至消失及线粒体融合。中、高剂量的纳米二氧化硅可导致心肌细胞线粒体功能下降。低、中剂量的纳米二氧化硅可引起心脏组织抗O2-·能力应激性升高，而高剂量的纳米二氧化硅则可导致心脏组织抗O2-·能力下降。中剂量的纳米二氧化硅可应激性诱导线粒体的生物合成，而高剂量的纳米二氧化硅则抑制线粒体的生物合成。结论高剂量的纳米二氧化硅可通过诱导线粒体内O2-·的产生、降低线粒体抗氧化能力，从而导致线粒体结构和功能的损伤，并抑制线粒体的生物合成。

纳米结构；环境暴露；毒性试验；纳米二氧化硅；心肌线粒体；线粒体生物合成

纳米二氧化硅具有比表面积大、分散性好、化学纯度高等性质，被广泛应用于化工生产、生物技术及生物医学等各个领域。纳米二氧化硅暴露所导致的呼吸系统疾病一直是人们关注的热点，但是对于其所引起的心血管系统毒性，尤其是心脏损伤作用，尚少见相关研究。流行病学调查研究显示，空气动力学直径＜2.5 μm的颗粒物可增加心血管疾病的发病率和死亡率［1-2］。实验室研究也发现，直径＜2.5 μm颗粒物可通过气血交换进入血液循环，直接作用于心脏和血管系统，引起心脏功能紊乱、心率变异性降低、心肌细胞变性、间质细胞增生以及心肌重构，甚至可以导致细胞线粒体及细胞核损伤，从而引起更为严重的有害生物学效应［3-5］。大量研究表明，包括颗粒物在内的一些环境污染物可导致线粒体毒性的发生或者通过线粒体毒性来发挥其主要的生物学效应［6-7］。但是关于纳米二氧化硅对心肌组织及线粒体的损伤作用及机制并不清楚。本实验采用非暴露式气管内注入法对Balb/c小鼠进行纳米二氧化硅（粒径为40 nm左右）暴露，检测心肌线粒体损伤相关指标，阐明纳米二氧化硅对心肌线粒体的损伤作用及机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器细胞色素c氧化酶1（Cytochrome c oxidase subunit1，COX1）、琥珀酸脱氢酶A（succinate dehydrogenase A，SDHA）抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司；GAPDH抗体购自Abcam公司；驴抗羊和羊抗兔荧光二抗购自LI-COR公司；BCA蛋白定量试剂盒购自杭州碧云天生物技术公司；抗超氧阴离子自由基测试盒以及三磷酸腺苷（ATP）含量测试盒均购自南京建成生物工程研究所。96孔培养板（COSTAR，美国）；移液器（GILSON，法国）；离心管（江苏海门塑料厂）；恒温水浴箱（北京医用设备厂）；TGL-16B型普通离心机（北京医用离心机厂）；JA1203电子天平（上海精科）；酶标仪（Themo，美国）；超低温冰箱（SANYO，日本）；101A-2型干燥箱（上海市实验仪器总厂）；低温高速离心机（Kontront-42k，德国），透射电子显微镜（TEM，JEOL JEM2100，日本）。

1.2 实验分组SPF级Balb/c小鼠40只，6～8周龄，体质量18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。采用随机抽样法将实验动物分为对照组和7、21、35 mg/kg纳米二氧化硅暴露组（低、中、高剂量组），每组10只。小鼠在5%水合氯醛（7 μL/kg）麻醉下，采用非暴露式气管内滴注法，滴注50 μL的纳米二氧化硅悬液，质量浓度分别为2.816、8.448、14.080 g/L，对照组滴注等体积生理盐水，每3 d染毒1次，共5次。染毒前小鼠禁食12 h。

1.3 纳米二氧化硅制备及表征观察采用Stöber法制备纳米二氧化硅：三颈瓶中依次加入无水乙醇50 mL、氨水2 mL、高纯水1 mL，在搅拌速度为150 r/min下迅速加入1.5 mL正硅酸乙酯（tetraethoxysilane，TEOS），反应12 h后停止；15 000 r/min离心30 min后，用无水乙醇和去离子水分别清洗3次，超声分散在无菌水中，即纳米二氧化硅母液；取分散好的母液，放入1 mL已称质量的离心管中，烘干40 h，称质量，计算母液的浓度。取少量纳米二氧化硅滴在铜网上，自然晾干，于透射电子显微镜下观察其形态。母液用于动物实验前再超声5 min，用生理盐水稀释调节浓度。

1.4 电镜观察心肌细胞线粒体超微结构改变纳米二氧化硅染毒结束24 h后，颈椎脱臼处死小鼠，迅速摘取对照组和高剂量组小鼠心脏组织，生理盐水漂洗后，4℃2.5%戊二醛溶液中进行前固定，并在固定液中将心脏组织剪成1 mm×1 mm×1 mm大小。送至电镜中心制备组织电镜标本。随后在透射电子显微镜下观察心肌细胞线粒体的超微结构。

1.5 心肌细胞线粒体功能的检测称取50 mg心肌组织，加入9倍体积的沸双蒸水，制成10%的匀浆液，再置于沸水浴中煮10 min，取出混匀抽提1 min，3 500 r/min离心10 min，取上清液BCA法检测蛋白浓度，并根据试剂盒操作步骤检测ATP浓度，结果用单位质量蛋白中ATP的含量表示。

1.6 心肌组织抗超氧阴离子（O2-·）自由基能力的检测准确称量心脏组织，按照质量（g）∶体积（mL）=1∶9的比例加入无菌生理盐水，于冰水浴中匀浆，3 700×g离心10 min，取上清液BCA法检测蛋白浓度，并根据试剂盒操作步骤检测心肌组织抗O2-·自由基能力，结果用单位质量蛋白的抗O2-·的活力单位表示。

1.7 Western blot法检测COX1和SDHA蛋白表达水平采用RIPA裂解液提取心肌组织蛋白。BCA试剂盒进行蛋白定量后，调整各组织蛋白浓度，加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上样缓冲液后对蛋白样品进行变性。将变性后的蛋白加入12%SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离，蛋白上样量为60 μg。电泳开始电压为80 V，染料进入分离胶后，增加到180 V。在转移缓冲液中将蛋白质转移至PVDF膜，电流为100 mA，转膜时间为2 h。将取出的膜放入10 mL封闭液中，室温轻摇2 h加入一抗，过夜。取出后用TBST室温洗膜3次。再加入二抗，室温摇床上孵育1 h。再用TBST室温洗膜3次后采用Li-Cor Odyssey system进行曝光。用Quantity One 4.6.2图像分析软件进行灰度分析，对目标蛋白进行定量。以GAPDH作为内参来确定目标蛋白的表达。

1.8 统计学方法采用SPSS 13.0统计软件进行分析，数据以均数±标准差表示，多组间均数比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 纳米二氧化硅颗粒的表征高压灭菌后纳米二氧化硅颗粒在0.9%生理盐水中的电镜照片见图1。二氧化硅颗粒呈椭球形，大小基本无差别，分布均匀一致，单分散性较好。

Fig.1Transmission electron microscopy image of amorphous silica particles图1 纳米二氧化硅的形貌（TEM）

2.2 纳米二氧化硅对心肌线粒体超微结构的影响对照组小鼠心肌细胞线粒体膜完整，无水肿，内膜嵴密度正常，并且排列整齐；高剂量组线粒体呈现肿胀、嵴排列紊乱、断裂，甚至消失，见图2。

Fig.2The effect of silica nanoparticles on the ultrastructure of myocardial mitochondria图2 纳米二氧化硅对心肌细胞线粒体超微结构的影响

2.3 纳米二氧化硅对心肌细胞线粒体功能的影响与对照组相比，低剂量组ATP浓度无明显变化（P＞0.05），中、高剂量组ATP浓度明显降低（均P＜0.05），见图3。

Fig.3The effect of silica nanoparticles on ATP generation in myocardial mitochondria图3 纳米二氧化硅对心肌细胞线粒体ATP生成的影响

Fig.4The effect of silica nanoparticles on anti-superoxide anion activity in myocardial cells图4 纳米二氧化硅对心肌细胞抗?能力的影响

2.5 纳米二氧化硅对心肌细胞线粒体新生的影响各组心肌组织中COX1蛋白表达水平以及COX1与SDHA蛋白表达水平的比值差异均有统计学意义（F分别为132.665、137.069，均P＜0.05）。（1）COX1蛋白表达水平。低、中剂量组与对照组差异均无统计学意义，高剂量组低于对照组（P＜0.05）。（2）COX1与SDHA蛋白表达水平的比值。低剂量组与对照组差异无统计学意义，中剂量组高于对照组，高剂量组低于对照组（P＜0.05），见图5。

Fig.5The effect of silica nanoparticles on myocardial mitochondrial biogenesis图5 纳米二氧化硅对心肌细胞线粒体新生的影响

3 讨论

纳米二氧化硅可以通过多种途径（吸入、摄入及注射等）进入体内［8-9］。大多数研究认为吸入途径是人群暴露纳米颗粒的主要途径［10］，因此本实验采用气管注入的暴露方式给予小鼠高、中、低3种剂量的纳米二氧化硅染毒。WHO空气质量准则2005年版中规定，空气中细颗粒物24 h平均浓度限值的准则值为25 μg/m3［11］。成年小鼠体质量以20 g计，每次呼吸空气吸入量为0.15 mL，呼吸频率为163次/ min，计算得日吸入空气量为35 L。毒理学中由动物实验外推到人时，安全系数为100。按照WHO标准，成年小鼠日吸入细颗粒物为0.88 μg，即44 μg/ kg，因此本次实验染毒剂量选为7、21、35 mg/kg，约为空气质量准则中细颗粒物24 h平均浓度的100、300和500倍。大量研究表明，吸入的空气超细颗粒物可以通过“血肺屏障”进入循环系统，转移到心脏、肝脏、肾脏以及中枢神经系统，从而引起一系列的生物学效应［12-14］。Du等［15］研究发现，纳米二氧化硅可引起大鼠心肌组织氧化损伤以及炎症反应，并且可导致心肌细胞凋亡的发生。且有研究表明，低剂量的纳米二氧化硅暴露可导致斑马鱼胚胎心脏氧化损伤以及炎症的发生，并可以引起心脏收缩功能障碍［16］。因此，笔者推测纳米二氧化硅颗粒的暴露可能是心血管系统疾病的一个潜在危险，但其具体作用及机制并不清楚。

线粒体占心肌细胞体积的40%～60%左右，是心肌细胞内最重要的细胞器之一，只要其发生轻微的变化就能引起心肌细胞甚至整个心脏功能的巨大变化［17］。线粒体是细胞能量的主要来源，同时线粒体呼吸链也是活性氧（ROS）的主要来源。有研究表明线粒体是空气颗粒物作用的敏感靶标［18-20］，且细颗粒物可导致心肌细胞线粒体结构和功能损伤，破坏线粒体融合和分裂的动态平衡［6,21］。本研究结果显示，高剂量的纳米二氧化硅可以导致线粒体结构的损伤，主要表现为线粒体肿胀、线粒体嵴排列紊乱甚至消失及线粒体融合，并且中剂量和高剂量的纳米二氧化硅可导致心肌细胞线粒体功能的下降，与以往研究结果基本一致。

目前多项研究表明，细颗粒物的心肌细胞毒作用机制主要涉及ROS、活性氮、氧化应激、钙离子稳态以及炎症反应等方面［22］。线粒体既是细胞生成ROS的主要场所，同时也是ROS攻击的首要靶标。本研究结果显示，低、中剂量的纳米二氧化硅可引起心脏组织抗O2-·能力应激性升高，而高剂量的纳米二氧化硅则可导致心脏组织抗O2-·能力的下降，提示高剂量的纳米二氧化硅可导致心肌细胞线粒体O2-·的产生增加，降低心肌细胞线粒体抗氧化损伤的能力，说明纳米二氧化硅对心脏的损伤作用主要与ROS和氧化应激反应相关。

心肌细胞线粒体的生物合成非常活跃，当细胞线粒体发生损伤时，线粒体生物合成就是细胞的一种保护机制。SDHA为线粒体复合物Ⅱ的亚单位，是核DNA编码的蛋白；COX1为线粒体复合物Ⅳ的亚单位，是线粒体DNA编码的蛋白，两者的比值可反映线粒体的生物合成情况。因此本实验通过对心脏组织内COX1和SDHA的蛋白表达水平进行检测，并通过二者的比值来评价纳米二氧化硅对心肌细胞线粒体生物合成的影响。结果显示，中剂量的纳米二氧化硅可应激性诱导线粒体的生物合成，而高剂量的纳米二氧化硅则抑制线粒体的合成，提示随着纳米二氧化硅暴露剂量的增加，线粒体生物合成受到抑制。结合心脏组织抗O2-·能力、ATP浓度以及线粒体结构的检测结果，笔者推测低、中剂量的纳米二氧化硅可引起心肌细胞抗氧化能力应激性地升高，从而发挥抵抗纳米二氧化硅的心肌毒性作用，而高剂量的纳米二氧化硅可引起心肌细胞氧化和抗氧化状态的失衡，从而导致线粒体的损伤以及抑制线粒体的生物合成。

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（2016-05-27收稿2016-09-19修回）

（本文编辑陈丽洁）

Toxic effects of silica nanoparticles on myocardial mitochondria

LIANG Baolu,YANG Man,WU Peng,LI Yanbo,JING Li△,SUN Zhiwei
School of Public Health,Capital Medical University,Beijing 100069,China△

ObjectiveTo investigate the toxic effects and mechanisms of silica nanoparticles on myocardial mitochondrial.MethodsThe Balb/c mice were intratracheally instilled with silica nanoparticles(40 nm)at three doses of 7,21 and 35 mg/kg every three days for a total of 5 times.Control group was given the same volume of normal saline.The transmission electron microscope was used to observe the ultrastructure of myocardial mitochondria.By measuring the concentration of ATP，the effect of silica nanoparticles on the function of myocardial mitochondria was evaluated.Through the detection of the ability of anti O2-·in the myocardial tissue,the antioxidant capacity of mitochondria in cardiac muscle was evaluated.The expression levels of cytochrome coxidase subunit 1(COX1)and succinate dehydrogenase subunit a(SDHA) were detected by Western blot assay.ResultsThe results showed that silica nanoparticles at high dose can damage the structure of myocardial mitochondrial,which induced swelling of mitochondria，mitochondrial cristae disorder disappeared and even mitochondrial fusion.Silica nanoparticles(21 and 35 mg/kg)can induced the decrease in functions of mitochondria.Silica nanoparticles(7 and 21 mg/kg)can enhance the myocardial antioxidant capacity.But high dose of silica nanoparticles can induce the decrease in the myocardial antioxidant capacity.Silica nanoparticles(21 mg/kg)induced mitochondrial biosynthesis,but high dose of silica nanoparticles(35 mg/kg)inhibited mitochondrial biosynthesis. ConclusionSilica nanoparticles(35 mg/kg)can induce the production of O2-·and decrease the antioxidant capacity of mitochondria,which leads to the damage of the function and structure of the mitochondria and inhibits the mitochondria biosynthesis.

nanostructures;environmental exposure;toxicity tests;silica nanoparticles;myocardial mitochondrial; mitochondria biosynthesis

R122.2

A

10.11958/20160476

国家自然科学基金资助项目（81402709，81573176）；北京市自然科学基金项目（7162021）

首都医科大学公共卫生学院（邮编100069）

梁宝璐（1988），女，主管技师，硕士在读，主要从事卫生毒理、实验技术与管理工作

△通讯作者E-mail:jingli@ccmu.edu.cn