纳米银材料溶血试验研究

杨立峰 颜林 柯军 曹穗兰 田胜慧 国家食品药品监督管理局广州医疗器械质量监督检验中心 （广州 510080）

纳米银材料溶血试验研究

杨立峰 颜林 柯军 曹穗兰 田胜慧 国家食品药品监督管理局广州医疗器械质量监督检验中心 （广州 510080）

目的：检测并比较不同浓度纳米银的溶血率，得出纳米银浓度与溶血率的关系。方法：依次制备20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL五个不同梯度浓度的纳米银颗粒溶液，参照GB/T14233.2的方法进行溶血试验，同时选择两种市面上的纳米银抗菌敷料进行溶血试验。结论：纳米银浓度越高其溶血率越大，浓度为2.5μg/mL以上的纳米银溶液溶血率均大于5%，两种纳米银抗菌敷料的溶血率也均大于5%。

纳米银 溶血试验 溶血率

0.引言

纳米银因其具有光谱的抗菌作用，被广泛的应用于医疗领域。但最近研究者发现纳米材料因其特有的尺寸小、比表面积大及活性强的特点对人体具有一定的细胞毒性、遗传毒性和生殖毒性[1]，并且在体内可以蓄积到重要的脏器器官并引起毒性反应[2～3]。关于纳米银材料的溶血性能目前还没有相关文献报道，因此，本文采用不同浓度的纳米银颗粒和已在市面上销售的纳米银抗菌敷料分别进行了溶血试验。

1.材料

1.1 试验样品：纳米银颗粒溶液（2000μg/mL）、

纳米银抗菌敷料A、纳米银抗菌敷料B。

1.2 试剂耗材：草酸钾溶液（2%），离心管（15mL），移液枪（eppendorf）。

1.3 设备：可见紫外分光光度计、离心机、恒温水浴箱。

1.4 实验动物：新西兰大白兔，2.5kg，来源：广东省医学实验动物中心，合格证号：合格证书：SCXK(粤）2014-0035（44411600002078）。

2.方法

2.1 样品和对照品制备

2.1.1 纳米银溶液制备

将2000μg/mL纳米银颗粒溶液依次稀释为20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/ mL五个不同浓度的纳米银颗粒溶液，将上述溶液分别加入15mL离心管内，每管10mL，每个浓度各制备3管。

2.1.2 纳米银抗菌敷料制备

参照GB/T 16886.12-2005标准，将纳米银抗菌敷料按3cm2/mL比例进行浸提[4]，即取30cm2敷料（包括纳米银部分）加入到离心管内，再加入10mL生理盐水，纳米银抗菌敷料A和敷料B各制备3管。

2.1.3 对照品制备

离心管内加入10mL生理盐水作为阴性对照，离心管内加入10mL蒸馏水作为阳性对照，阴性对照和阳性对照各制备3管。

2.2 稀释抗凝兔血制备

心脏采取家兔血液4mL（2%草酸钾溶液1:9抗凝），与5mL生理盐水稀释混匀。

2.3 试验步骤

将样品管，阴性对照管和阳性对照管放入水浴箱内37°C水浴30min，向各管内分别加入0.2mL稀释抗凝兔血，继续在恒温水浴箱内37°C水浴60min，水浴结束后取出试管，放入离心机内800g离心5min，观察试管内上清液的颜色变化，吸取上清液，用紫外分光光度计在545nm处读取吸光度值。试验前先测量样品本底的吸光度值。

3.结果

3.1 肉眼观察

图1为各浓度纳米银溶液的本地颜色，图2为各浓度纳米银溶液的溶血情况，可见纳米银浓度越高其溶血越严重。

3.2 溶血率

溶血率计算公式如下：

图1. 纳米银溶液本底颜色

图2. 纳米银溶液的溶血情况

表1. 溶血率

图3. 纳米银溶血率（%）

式中：A为样品组平均吸光度值；A0为样品吸光度本底值；B为阴性对照组平均吸光度值；C为阳性对照组平均吸光度值。

各组的溶血率见表1，纳米银浓度与溶血率关系见图3，纳米银浓度越高其溶血率越大，2.5μg/ mL即以上浓度的纳米银溶液溶血率均大于5%，敷料A和敷料B的溶血率也远大于5%，按照GB/T14233.2标准规定，溶血率大于5%则一般认为不合格[5]。

4.讨论

溶血试验主要是用于检测材料所导致的红细胞膜破坏，从而使细胞内的血红蛋白释放到血浆中。本研究表明纳米银对红细胞具有很强的破坏作用，且溶血程度与纳米银的浓度呈正相关。对于与循环血液直接接触的纳米银医疗器械需要进行溶血试验，而对于非与循环血液接触的纳米银医疗器械是否有必要进行溶血试验呢，有研究表明纳米银与组织接触后可以通过生物屏障进入血液循环系统[6]，从而被运输到全身各个脏器组织。如纳米银抗菌敷料，纳米银既可以通过伤口进入血液循环系统，也可以通过组织细胞的吞噬吸收进入到循环系统，因此有必要对这类产品进行溶血试验。

有文献报道当纳米银浓度达到25μg/mL及以上时具有明显的体外细胞毒性[7]，本试验结果显示，纳米银浓度为2.5μg/mL时其溶血率已超过5%，GB/T14233.2标准规定溶血率的可接受范围为＜5%，由此可见对于纳米银材料其溶血试验较细胞毒性试验更为灵敏。纳米银的毒性除与浓度相关外还与粒径相关，粒径越小其毒性越大。

本试验选择了已在临床上使用的两种纳米银抗菌敷料进行了溶血试验，结果显示溶血率均远大于5%，不符合GB/T14233.2标准的规定，但在临床上并未发生不良反应，有可能是因为应用部位纳米银浓度高但实际进入到循环血液中的纳米银浓度比较低。关于纳米银的局部使用浓度与进入到循环血液量的关系有待进一步研究。

近年来，学者们对纳米材料的生物安全性做了大量研究，并且已深入到了基因和分子生物学水平，发现纳米材料确实存在着一定的毒性，这也引起了政府监管部门对纳米材料的高度重视，并加强了对这类产品的监管控制，但是这类产品在临床上确实起到了很好的效果，是传统医疗器械无法替代的。因此，我们对于纳米医疗器械的监管不应采取一刀切的模式，对于只应用于体表的纳米医疗器械应放宽监管，对于应用于体内组织及器官的纳米医疗器械应加强监管，并建立适合于纳米材料的生物学评价和试验方法。

[1] 于永生，施畅，徐丽明，等，纳米银对中国仓鼠肺成纤维细胞的细胞毒性和遗传毒性[J]. 癌变·畸变·突变，2014，26（6）: 428-433.

[2] 陈丹丹，奚廷斐，白净，等，纳米银和微米银在大鼠组织器官中的分布[J]. 北京生物医学工程，2007,26（6）：607-608,611.

[3] 姗姗，薛玉英，唐 萌，等，纳米银在小鼠体内的组织分布[J]. 东南大学学报(自然科学版), 2012,42(2):388-392.

[4] GB/T 16886.12-2005 医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品[S].

[5] GB/T 14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学试验方法[S].

[6] Loeschner K，Hadrup N，Qvortrup K，et a1.Distribution of silver in rats following 28 days of repeated oral exposure to silver nanoparticles or silver acetate [J].Particle and Fibre Toxicology,2011,8(1):18—31.

[7] 熊 玲,蒋学华,陈 亮,等，不同粒径银粒子的体外细胞毒性比较[J],中国生物医学工程学报，2007，26（4）：600-604.

Hemolysis Test of Nano Silver

YANG Li-feng YAN Lin KE Jun CAO Sui-lan TIAN Sheng-hui Guangzhou Medical Instruments Quality Surveillance and Inspection Center of State Food and Drug Administration (Guangzhou 510080)

Objective: To test and compare the different concentration of hemolysis rate of silver nanoparticles, Obtained the relationship between the concentration of nano silver and the hemolysis rate was. Methods: Prepared 20μg/mL, 10μg/mL, 5μg/mL, 2.5μg/mL, 1.25μg/mL five different concentration of silver nanoparticles solution, The method reference to GB/T14233.2. In addition, two kinds of nano silver antimicrobial dressing on the market were selected to carry out hemolysis test. Conclusion: The higher the concentration of nano silver, the greater the hemolysis rate. The nano silver solution was more than 2.5 g/mL, and the hemolysis rate was more than 5%. The hemolysis rate of two kinds of nano silver antimicrobial dressing was greater than 5%.

nano silver, Hemolysis test, hemolysis rate

1006-6586(2016)07-0050-03

R318.08

A

2016-03-18

杨立峰，工程师；颜林，高级工程师，副所长；柯军，工程师，室主任；曹穗兰，助理工程师；田胜慧，工程师。

广东省科技厅资助项目，广东省医疗产品生物安全评价科技服务平台（2012B011000003）