奶牛布鲁氏菌抗体检测常用方法的筛选

毛爱民范 锋杨芝芬陆宇超金嘉旻施铭煜

(1.无锡市动物疫病预防控制中心,江苏无锡 214021; 2.无锡市惠山区堰桥街道兽医站,江苏无锡 214021)

奶牛布鲁氏菌抗体检测常用方法的筛选

毛爱民1范 锋1杨芝芬1陆宇超1金嘉旻1施铭煜2

(1.无锡市动物疫病预防控制中心,江苏无锡 214021; 2.无锡市惠山区堰桥街道兽医站,江苏无锡 214021)

目前，奶牛布鲁氏菌病血清学检测最常用的方法包括虎红平板凝集试验（RBT）、试管凝集试验（SAT）和酶联免疫法（EILSA）、金标试纸法（GICA）。前两种是国家规定的标准方法，后2种是近年来才开始使用，但没列入国家标准的新方法。为了筛选出最适合的检测方法，我们对近5年来留存的奶牛虎红平板检测为阳性血清82份、阴性血清100份和40份人工调配的布病标准阳性血清进行了4种方法的比较，结果显示，EILSA法特异性强，灵敏度最高，GICA操作最简便，耗时最少。因此，在奶牛布病检测方法上选用GICA、EILSA组合较为合适。

布病 ELISA GICA

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的人畜共患传染病。以生殖器官和胎膜发生炎症，引起流产、不孕和关节炎、睾丸炎等为特征。患病动物长期带菌，成为世界性分布，有不同程度的流行，给畜牧业和人类健康带来严重危害。本病在我国分布较广，在某些地区的流行相当严重。在自然条件下，布鲁氏菌病的易感动物范围很广，其中主要是羊、牛、猪。本病在流行病学、临床症状、病理变化均缺乏明显特征，而且多数病畜呈隐性感染，因此，在诊断时，应采取多种方法互相配合，才能得出正确诊断结果。目前，我国布病最常用的检疫技术是血清学诊断，国标方法有虎红平板凝集试验、试管凝集试验和补体结合试验以及乳牛全乳环状试验。但在临床上用得最多的是虎红平板凝集试验，该方法虽然时间短，操作简便，但容易出现假阳性、假阴性等情况，给诊断带来一定困难，因此，为挑选出操作简便、准确率高的方法，我们对目前国内外使用较多的虎红平板凝集试验（RBT）、试管凝集试验（SAT）和酶联免疫法（EILSA）、金标试纸法（GICA）四种方法进行了比较，检测数据如下：

1 材料与方法

1.1 标准阳性血清

厂家：青岛易邦公司，批号：20160402。

1.2 标准阴性血清

1.3 虎红平板抗原

厂家：青岛易邦公司，批号：20160403。

1.4 试管凝集抗原

厂家：青岛易邦公司，批号：20160201。

1.5 胶体金试纸条

厂家：韩国安捷生产的牛布病金标试纸卡。

1.6 酶联免疫试剂盒

由表1可知，血液组水蛭素活性为(76.171 9±0.390 6)U/g，配合饲料组水蛭素活性为(75.390 6±0.391 8)U/g。血液组水蛭素活性略高于配合饲料组，但在统计学意义上，差异性不显著（P＞0.05）。

厂家：美国IDEXX牛布氏杆菌抗体检测试剂盒 。

1.7 血清样品

2013年起收集的奶牛血清虎红试验阳性82份、阴性100份。冷冻于-20℃保存，使用前统一解冻。

1.8 人工样品

标准阳性血清按1：2，1：4，1：8，1：16… … 1：1024梯度稀释至10个浓度的样本，每个浓度各5份，共50份待检样本。

1.9 检测方法

RBT、SAT按GB/T 18646-2002动物布鲁氏菌病诊断技术规范操作，GICA、ELISA按产品说明书操作。

1.9.1 GICA法：将未开封的试纸卡和检测样品恢复至室温；用吸管吸取血清，向平坦放置的试纸卡加样孔中缓慢滴入1滴；取出试纸卡包装中的稀释液，用吸管吸取，向试纸卡的加样孔缓慢滴入2滴；5min判断结果，10min后的结果无效。阳性：C线显示红色色带，T线也显示红色色带，无论颜色深浅均判为阳性。阴性：C线显示红色色带，T线不显示红色色带，判为阴性。无效：C线不显示红色色带，无论T线是否显示红色色带，该试纸均判为无效。

1.9.2 ELISA 法：取出包被反应板，在记录表上记录好每个样品的相应位置。每个孔中加入190μl “稀释缓冲液N.2”，在一个适当孔加入10μl未稀释的阴性对照。在两个适当孔分别加入10μl未稀释的阳性对照。在剩余孔加入10μl未稀释的样品。使用微量板振荡器充分混匀孔中内容物。盖上盖板（盖子，铝箔膜或粘贴膜）进行孵育：单个样品在18℃～26℃条件下孵育1h（±5min）（短期孵育模式）或者在18℃～26℃条件下孵育16～24h（过夜孵育模式）。混合样品：在18-26℃条件下孵育1h（±5min）（短期孵育模式）。用近300μl 左右的洗涤溶液，每个板孔洗涤3 次。在每一次洗涤后，吸去每个板孔中的液体。在最后一次甩板后，在吸水材料上用力扣板，吸去剩余的液体。在洗涤和加入下一个试剂前，避免微量板变干。每孔加入100μl 稀释好的酶标抗体。盖上盖板（盖子，铝箔膜或粘贴膜），在18℃～26℃条件下孵育30min（±3 min）。重复洗涤步骤，然后每孔加入100μl TMB 底物溶液N.13。在18℃～26℃条件下避光孵育20 min（±3 min）。每孔加入100μl 终止液N.3。轻轻晃动反应板。仔细擦拭反应板底部。将酶标仪空气调零。测量并记录样品和对照在450nm 下的吸光值。结果判定，单个血清：样品的S/P百分率小于或等于110%时，认为样品中不存在布鲁氏菌特异性抗体，判为阴性。样品的S/P百分率在110%～120%之间时，判为可疑。样品的S/P百分率大于或等于120%时，认为样品中存在布鲁氏菌特异性抗体，判为阳性。混合血清：样品的S/P百分率小于20%时，认为样品中不存在布鲁氏菌特异性抗体，判为阴性；样品的S/P百分率大于或等于20%时，认为样品中存在布鲁氏菌特异性抗体，判为阳性。

2 结果与分析

2.1 检测182份血清样品和50份人工样品整个实验耗时

同一实验的所有样本都是尽量统筹时间一同开展，经比较，采用GICA时间最短1小时内就测得所有结果，SAT法耗时最长。

2.2 结果

2.2.1 血清样本检测结果

表2 布病抗体检测4种常用方法检测结果表

以 SAT为标准，RBT、GICA、EILSA假阳性率分别为6.1%、6.1%、0。假阴性率分别为0、2%、1%。

2.2.2 人工样本检测结果

表3 布病抗体检测4种常用方法阳性最低检出浓度表

最低检出浓度按照同一浓度5份样本中有至少3份呈阳性为准。检测结果显示，EILSA检测灵敏度最大，RBT、GICA灵敏度基本一致，较低。

3 小结

（1）布鲁氏杆菌病是由布鲁氏杆菌引起的一种人畜共患传染病，属于我国的二类传染病。奶牛是布鲁氏杆菌易感的动物，一旦在牛群中发生，将导致巨大的经济损失和严重的公共卫生问题，因此，奶牛布病是各级兽医机构必检项目。检测奶牛布病的试验方法多达10多种，但临床上常见的就是3～4种。目前我国布病的血清学诊断主要使用RBT、SAT。实验证明，这2种方法都会出现一定比例的假阴性和假阳性，我国大部分地区，实行的是RBT初筛，SAT复核的配套方式来监测监控奶牛布病。国际标准中，世界动物卫生组织OIE国际贸易指定试验为BBATs（缓冲布病抗原试验）、ELISA和CFT（补体结合实验）。SAT过去一直是许多国家布病诊断的常规血清学方法，但单独应用SAT可能出现假阳性或假阴性，而且不是所有感染动物都出现具有诊断意义的抗体水平，因而易造成误诊和漏诊。特别是SAT用于牛布病检测时结果不令人满意，OIE已经于2000年宣布不主张用于国际贸易。

（2）本次试验的显示，GICA相对于RBT，检测结果基本趋于一致，而且GICA出现假阴性的结果要小于RBT。ELISA相对于SAT，无论是敏感度还是特异性，前者都优于后者，而且在时间效率上，前者更是有着天然的优势。SAT由于采用人工目测比对，很容易出现临界值难以判断，经常得出可疑的结论，需耗费精力二次检疫。GICA、ELISA都能使用血浆进行检测，而RBT必须用血清才能检测，无锡市目前在奶牛结核病检测上使用的r-干扰素释放法，检测材料也需要血浆，用GICA、ELISA组合，可以解决采一次抗凝血同时解决所有项目的检测任务，在无锡地区经过实际检验，从提高效率和准确率出发，奶牛布病检测方法更适合使用GICA、EILSA组合。但从检测成本来看，GICA、EILSA配套相对高于RBT、SAT，在经济落后地区大面积推广会存在困难。

[1] 于力，于康震.动物传染病学[M].中国农业出版社，1998.