白腐真菌降解秸秆条件的研究

刘海霞 张 力 叶 武

(江苏农牧科技职业学院 动物科技学院,江苏泰州 225300)

白腐真菌降解秸秆条件的研究

刘海霞 张 力 叶 武

(江苏农牧科技职业学院 动物科技学院,江苏泰州 225300)

本试验从温度、pH值、接种量以及秸秆中的水分含量等优化指标，研究白腐真菌发酵秸秆前后纤维素和木质素的变化。试验发现，在秸秆含水量为60%，温度在30℃，接种量为0.25g/kg，酸度控制在pH为5.0的条件下发酵7天的效果比较显著。本试验研究为白腐真菌处理秸秆饲料提供理论依据。

白腐真菌 秸秆发酵 饲料 单因素

我国年产各类农作物秸秆达5.7亿t，占世界秸秆总产量的20%～30%[1-2]，但是，其中绝大部分并未得到充分利用，随着畜牧业的快速发展，饲料资源日趋紧张，开发利用秸秆饲料发展食草型、节粮型畜牧业不仅可节约饲料资源，而且可促进农业良性循环，合理有效地利用秸秆是饲料生产中的重要环节。本试验选取对秸秆降解效果较好的红芝（Ganoderma）和黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）两种白腐真菌发酵秸秆，通过改变培养基含水量、初始pH值、培养温度及菌种接种量，测定发酵前后秸秆纤维素和木质素的变化，研究不同单一因素对发酵秸秆效果的影响，为白腐真菌处理秸秆饲料提供理论依据。

1 材料

1.1 菌种

白腐真菌：红芝购自武汉食用菌栽培研究所，黄孢原毛平革菌由中科院北京植物研究所提供。

1.2 秸秆

稻草和小麦秸秆：将自然风干的秸秆粉碎、灭菌处理，过40目筛，备用。

1.3 培养基

1.3.1 PDA培养基（用于菌种保藏）

称取去皮新鲜土豆200 g，切成小块，加水至1 L，煮沸30 min。用纱布过滤后加20 g葡萄糖、20 g琼脂粉，在电炉上加热至琼脂溶化，加水补足1 L。分装至已空消过的试管中，置灭菌锅中121℃灭菌20 min。倾斜静置，待凝固后备用。

1.3.2 液体种子培养基（用于白腐真菌增富）

去皮马铃薯200 g，煮沸30 min，纱布过滤，加入20 g蔗糖，融化后补水至1000 mL，自然pH值，加入10 g秸秆粉，100 mL分装250 mL三角瓶，121℃间歇灭菌[3]。

1.3.3 固体培养基

水稻秸秆：麸皮=7∶3，（NH4）2SO41%，KH2PO4 0.2%，料水比=1∶4.5。每500 mL三角瓶含10 g培养基，121 ℃灭菌60 min。用于白腐真菌产酶[3]。

1.4 主要仪器

移液枪（Eppendorf公司）；灭菌锅（上海博讯，YXQ-LS-100SII）；无菌操作台（苏州净化；VS—1300U）；分析天平（赛多利斯，TE214S）；高温箱型电炉（上海博讯实业有限公司）。

1.5 药品

乙醚、乙醇、盐酸、硫酸、硼酸、氢氧化钠等常规分析药品。

2 方法

2.1 菌种活化

取4株斜面种子管分别接种于PDA培养基上，28 ℃倒置培养5 d。

2.2 液体培养

选取菌丝长势旺盛的平板，取菌苔前端接种于液体种子培养基，28℃恒温摇床（150 r/min）培养3～5 d，至长出可见的白色菌丝球，即可作为种子液使用。

2.3 发酵

将准备好的种子培养基和固体发酵培养基，每瓶按体积分数为10%的接种量接入菌种，25 ℃下静置培养。

2.4 不同培养条件对秸秆降解效果的影响

2.4.1 不同培养基含水量对秸秆降解效果的影响

调整固态发酵培养基中的含水量为60%、65%、70%，各10%的接种量接种红芝和黄孢原毛平革菌，在30℃，自然pH下，发酵稻草和麦秸20d，发酵后测定纤维素、木质素含量。

2.4.2 不同培养温度对秸秆降解效果的影响

将秸秆基础固态发酵培养基，以各10%的接种量接种红芝和黄孢原毛平革菌，在25℃、30℃、35℃不同温度下，发酵稻草和麦秸20d，发酵后测定纤维素、木质素含量。

2.4.3 不同菌种接种量对秸秆降解效果的影响

将秸秆基础固态发酵培养基，以总接种量分别为0.125g/kg、0.25g/kg、0.5g/kg接种红芝和黄孢原毛平革菌，在30℃，自然pH下，发酵稻草和麦秸20天，发酵后测定纤维素、木质素含量。

2.4.4 培养基不同初始pH值对降解效果的影响

调节基础固态发酵培养基的初始酸碱值，使pH分别为4.0、5.0、6.0，在30℃下，发酵稻草和麦秸20d，发酵后测定纤维素、木质素含量。

2.5 结果计算

将培养好的秸秆培养基置于烘箱中，于 80 ℃烘干48 h，将样品编号，采用范氏（Van Soest）纤维测定法测定中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）、酸性洗涤木质素（ADL）含量[4]，并计算中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、酸性洗涤木质素的降解率。

中性洗涤纤维含量的计算：NDF（%）=（W1－W2）/ W×100；式中：W1-玻璃坩埚和NDF重（g），W2-玻璃坩埚重（g），W-试样重（g）

酸性洗涤纤维含量的计算：ADF（%）=（G1－G2）/ G×100；式中：G1-玻璃坩埚和ADF重（g），G2-玻璃坩埚重（g），W-试样重（g）

半纤维素含量的计算：半纤维素（%）=NDF（%）－ADF（%）

纤维素含量的计算：纤维素=ADF（%）－经72%硫酸处理后的残渣（%）

酸性洗涤木质素（ADL）含量的计算：ADL（%）=残渣（%）－灰分（硅酸盐，%）

3 结果与分析

3.1 培养基含水量对秸秆降解效果的影响

在固态发酵中，培养物的气体交换是影响白腐真菌对秸秆降解作用的重要因素之一，而气体交换量是由固、液相之比决定，

含水量过高或过低都会阻止白腐真菌的生长。

由表1看出，在含水量为60%的情况下，红芝和黄孢原毛平革菌对于小麦秸和稻草的木质素降解率最高，与65%和70%的含水量相比，差异显著（P＜0.05）。因此确定发酵培养基的最适含水量为60%。

表1 培养基含水量对秸秆降解效果的影响（%）

3.2 温度对秸秆降解效果的影响

试验测试了不同温度条件下对麦秸和稻草降解效果的影响，详见表2。

表2 温度对秸秆降解效果的影响（℃）

由表2看出，温度对于木质素降解率差异极显著（P＜0.01），在30℃下，秸秆的木质素降解率最高，与其他温度相比差异显著（P＜0.05），试验表明，温度高低影响固体发酵的进度和秸秆木质素的降解率。温度过高，发酵基中自腐真菌生长受到抑制，会降低秸秆木质素的降解率；温度过低，则会导致固体发酵的进度减缓。因此确定发酵培养基的最适发酵温度为30℃。

3.3 接种量对秸秆降解效果的影响

试验测试了不同接种量麦秸和稻草降解效果的影响，详见表3。

表3 接种量对于秸秆降解的影响（g/kg）

由表3得知，菌种接种量在0.25g/kg时，秸秆木质素降解率最高，当接种量有0.125g/kg增加到0.25g/kg时，降解率显著升高，当接种量从0.25g/kg升高到0.5g/kg时，木质素降解率开始下降。在接种量较低时，菌丝在发酵基质上的生长点太少，对培养基中营养利用不够充分，菌种生长不好；当接种量超过一定量时，生长初期菌丝大量生长，需消耗大量营养，发酵基质中的营养物质大部分用于菌丝生长，而产酶阶段所需的营养物质利用受到限制。因此，接种量选择0.25g/kg较为合适。

3.4 pH对秸秆降解效果的影响

试验测试了不同pH对麦秆和稻草降解效果的影响，详见表4。

试验结果表明，pH在4.0的时候，秸秆木质素降解率最高。随着pH的增高，木质素的降解率减少。红芝和黄孢原毛平革菌适宜在微酸性环境内生长，其可在发酵早期产生有机酸，自腐真菌有较宽的初始pH范围。从图中可知，选择pH4.0最适合，木质素的降解率达到最高。

4 讨论

齐刚报道培养基初水分达到60%时，木质素降解率最高[5]。水分含量的增加有利于菌体对营养物质的输送，并且提高了酶的活性。水分含量过大时，严重降低了菌体对氧气的吸收和二氧化碳的排出，而且不利于发酵散发热量，引起蛋白质含量的减少。白腐真菌固体发酵秸秆时，水分含量过低会使菌丝的生长受到抑制，而水分过高又会影响氧气通入、产生的二氧化碳排出以及热量的散失，对菌丝的生长不利。本试验的数据显示，固体发酵秸秆的水分应控制在60%左右，以利于菌丝生长。

选择适宜的温度和酸度也会对木质素有影响，不同pH值会影响生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，从而影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄，本试验的数据显示，固体发酵秸秆的温度应控制在30℃左右，有利于菌丝生长。红芝发酵稻草的木质素降解率达到26.52%，发酵麦秸的木质素降解率达到35.45%，黄孢原毛平革菌发酵稻草的木质素降解率达到28.19%，发酵麦秸的木质素降解率达到23.60%。大多数白腐真菌适宜生长在微酸性环境内，pH值在4.0～5.0之间。在pH为5.0时，最有利于白腐真菌漆酶的分泌。本试验的数据显示，固体发酵秸秆的pH应控制在5.0左右，以利于菌丝生长。

菌种接种量过高，会因菌体生长过快而产生过多的代谢废物，抑制白腐真菌的生长；接种量过低，菌体生长缓慢，培养时间长，使发酵时间延长[6]。本试验选择白腐真菌发酵7天，接种量为0.25 g/kg秸秆，木质素降解率最高，红芝发酵稻草的木质素降解率达到36.64%；发酵麦秸的木质素降解率达到34.74%，黄孢原毛平革菌发酵稻草的木质素降解率达到40.78%，发酵麦秸的木质素降解率达到37.76%。

通过单因素分析，得到以下结论：在秸秆降解过程中，秸秆的含水量、温度、菌种接种量、酸度的不同对白腐真菌的生长和秸秆木质素、纤维素的降解均有影响，秸秆的含水量为60%，温度在30℃，接种量为0.25g/ kg秸秆，酸度控制在pH为4.0的条件下发酵7天的效果比较显著。

[1] 饶辉.国内外秸秆类微生物发酵饲料的研究及应用进展[J].安徽农业科学，2009，37（1）：159-161.

[2] 魏志文，赵士豪，李宝库.多菌株发酵秸秆饲料研究[J].安徽农业科学，2008，36（32）：14108-14110.

[3] 费尚芬，鹿宁，刘坤，等.白腐菌纤维素酶高酶活菌株的筛选[J].安徽农业科学，2006，34（1）：22-23.

[4] 张力，杨孝列.动物营养与饲料（第2版）[M].中国农业大学出版社，2012.

[5] 赵华，齐刚，代彦.酒糟和秸秆混合发酵生产蛋白饲料的研究[J].粮食与饲料工业，2004，（8）：36-37.

[6] 唐媛，谢冰，吕宝一，等.白腐真菌处理难降解有机物的培养条件及应用研究[J].世界科技研究与发展，2008，30（1）：60-65.

表4 pH对秸秆降解的影响

刘海霞（1974-），女，副教授，博士，研究方向为草食动物生产。

江苏省泰州市农业支撑项目（TN201518），江苏省大学生创新创业训练计划项目（201612806004Y），江苏农牧科技职业学院项目（NSFPT201506）